CCK-8實驗常見問題與解決辦法
發(fā)布時間：2023-03-17 瀏覽次數(shù)：376
做實驗都會遇到疑惑的地方，那么CCK-8實驗中常見的問題有哪些呢？有什么解決辦法？下面我們一起學習CCK-8常見問題與解決辦法。
Q1：CCK-8溶液對細胞的毒性大小如何？
A1：CCK-8溶液對細胞的毒性非常低，通常觀察不到細胞毒性。細胞在CCK-8法檢測后仍然可以正常生長，并可以用于其它的細胞實驗。但為了避免CCK-8溶液可能帶來的對于后續(xù)檢測的影響，除非該細胞極難獲得，否則不推薦把CCK-8溶液孵育過的細胞用于其它實驗。
Q2：做細胞活性檢測時，每孔應該接種多少個細胞？
A2：當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000個/孔(100 μL培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500個/孔(100 μL培養(yǎng)基)。
Q3：在實驗中OD值太高，怎么解決？
A3：a.可以縮短加入CCK-8后的培養(yǎng)時間。
b. 適當減少細胞的數(shù)量。
Q4：在實驗中OD值太低，怎么解決？
A4：a.適當增加細胞數(shù)量。
b.延長加入CCK-8溶液后的孵育時間。
Q5：培養(yǎng)基的本底顏色如酚紅會不會影響細胞活性的檢測呢？
A5：不會，培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光值而消去，因此不會對檢測造成影響。
Q6：只可以在450nm波長處測OD值嗎？
A6：可以在450nm波長處測OD值，但是若無此波長的濾光片，可選擇吸光度在430-490 nm之間的濾光片，但是450 nm濾光片的檢測靈敏度最高。
Q7：若是暫不檢測OD值，該如何處理？
A7：若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。
Q8：應該每次做標準曲線嗎？
A8：建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態(tài)不一定一樣，對于狀態(tài)不一樣的細胞，建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標準曲線。
Q9：CCK-8能否檢測細菌細胞？
A9：可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細胞。向100μl大腸桿菌培養(yǎng)液中加入10μl CCK-8溶液，并培養(yǎng)1-4個小時或過夜。
Q10：如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差？
A10：可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。
Q11：CCK-8能否對活細胞進行染色？
A11：不能。因為CCK-8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST-8)，并通過電子載體PMS將活細胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST-8上。生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能對細胞進行染色。
Q12：在做加藥實驗時，藥物對測定是否有影響？如何解決？
A12：有時會有影響。如果藥物具有還原性，會和CCK-8發(fā)生顯色反應，增加吸光度。解決辦法：首先要確認藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基 (加CCK-8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK-8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。
Q13：每次測定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？
A13：可能會有以下幾個原因：
①當在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。
②有可能會因為CCK-8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK-8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。
③每孔的細胞數(shù)量過多或過少。請預先在1,000-100,000個/孔 范圍內(nèi)摸索條件。
Q14：如何設定空白對照？
A14：在不含細胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時間，測定450nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時，還應考慮藥物的吸收，可在不含細胞，加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。
Q15：哪些物質(zhì)會影響CCK-8的測定？
A15：當有還原性物質(zhì)存在時會影響CCK-8的測定，例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。
Q16：說明書上僅寫了96孔板的測定方法，如果使用24孔板或12孔板，應該加多少量CC K-8試劑？
A16：一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10。
Q17：必須預培養(yǎng)細胞嗎？
A17：不一定。如果要想保持細胞的最好狀態(tài)，建議預培養(yǎng)細胞。如果不做細胞預培養(yǎng)，細胞內(nèi)的脫氫酶可能會不穩(wěn)定。也有人不做細胞預培養(yǎng)，但在做標準曲線和檢測時需要統(tǒng)一檢測條件。
Q18：如果加入的藥物中含有金屬，是否會有影響？
A18：金屬對CCK-8顯色有影響。終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm，將會100%抑制。
Q19：CCK-8試劑的保存條件？
A19：在避光條件下CCK-8試劑在4℃可保存一年。如果需要保存較長時間的話，推薦在-20℃下保存。但是CCK-8若反復解凍和冰凍將會增加空白吸收，從而影響檢測結(jié)果，若經(jīng)常使用可將試劑存放在4℃冰箱內(nèi)保存，分批使用建議分裝保存。
Q20：CCK-8對于不同的細胞，靈敏度是否一樣？
A20：不一樣，懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞，一般加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時吸光度已經(jīng)很高，但對于懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數(shù)量來解決。
Q21：有時在藥物作用情況下，細胞已經(jīng)死亡，但是脫氫酶的活性還在，是否能計算細胞數(shù)量？
A21：不能。由于CCK-8是通過和細胞內(nèi)的脫氫酶進行反應間接反映活細胞數(shù)量，如果細胞已經(jīng)死亡，但脫氫酶的活性還在，則試劑測定的細胞數(shù)量將會比真實值高，不能真實反映活細胞數(shù)量，建議采用別的方法測定。
Q22：實驗之前，是否需要先檢測一下培養(yǎng)基和CCK-8是否會反應？
A22：需要，可用一個孔檢測一下，因為有培養(yǎng)基中可能含有氧化還原反應的物質(zhì)，在正式實驗之前有必要先確認培養(yǎng)基和CCK-8是否反應。一般正常在的OD值應該在0.4以下。
來源：“金沙生物”公眾號
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