中國工程院食品安全院士團(tuán)隊(duì)

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做實(shí)驗(yàn)都會遇到疑惑的地方，那么CCK-8實(shí)驗(yàn)中常見的問題有哪些呢？有什么解決辦法？下面我們一起學(xué)習(xí)CCK-8常見問題與解決辦法。

Q1：CCK-8溶液對細(xì)胞的毒性大小如何？

A1：CCK-8溶液對細(xì)胞的毒性非常低，通常觀察不到細(xì)胞毒性。細(xì)胞在CCK-8法檢測后仍然可以正常生長，并可以用于其它的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。但為了避免CCK-8溶液可能帶來的對于后續(xù)檢測的影響，除非該細(xì)胞極難獲得，否則不推薦把CCK-8溶液孵育過的細(xì)胞用于其它實(shí)驗(yàn)。

Q2：做細(xì)胞活性檢測時(shí)，每孔應(yīng)該接種多少個(gè)細(xì)胞？

A2：當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000個(gè)/孔(100 μL培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500個(gè)/孔(100 μL培養(yǎng)基)。

Q3：在實(shí)驗(yàn)中OD值太高，怎么解決？

A3：a.可以縮短加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間。
        b. 適當(dāng)減少細(xì)胞的數(shù)量。

Q4：在實(shí)驗(yàn)中OD值太低，怎么解決？

A4：a.適當(dāng)增加細(xì)胞數(shù)量。
        b.延長加入CCK-8溶液后的孵育時(shí)間。

Q5：培養(yǎng)基的本底顏色如酚紅會不會影響細(xì)胞活性的檢測呢？

A5：不會，培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過扣除空白孔中本底的吸光值而消去，因此不會對檢測造成影響。

Q6：只可以在450nm波長處測OD值嗎？

A6：可以在450nm波長處測OD值，但是若無此波長的濾光片，可選擇吸光度在430-490 nm之間的濾光片，但是450 nm濾光片的檢測靈敏度最高。

Q7：若是暫不檢測OD值，該如何處理？

A7：若暫時(shí)不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。

Q8：應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？

A8：建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的，但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣，對于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞，建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Q9：CCK-8能否檢測細(xì)菌細(xì)胞？

A9：可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細(xì)胞。向100μl大腸桿菌培養(yǎng)液中加入10μl CCK-8溶液，并培養(yǎng)1-4個(gè)小時(shí)或過夜。

Q10：如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差？

A10：可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。

Q11：CCK-8能否對活細(xì)胞進(jìn)行染色？

A11：不能。因?yàn)镃CK-8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST-8)，并通過電子載體PMS將活細(xì)胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST-8上。生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能對細(xì)胞進(jìn)行染色。

Q12：在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，藥物對測定是否有影響？如何解決？

A12：有時(shí)會有影響。如果藥物具有還原性，會和CCK-8發(fā)生顯色反應(yīng)，增加吸光度。解決辦法：首先要確認(rèn)藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測定450  nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基 (加CCK-8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK-8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。

Q13：每次測定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？

A13：可能會有以下幾個(gè)原因：
①當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。
②有可能會因?yàn)镃CK-8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK-8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。
③每孔的細(xì)胞數(shù)量過多或過少。請預(yù)先在1,000-100,000個(gè)/孔 范圍內(nèi)摸索條件。

Q14：如何設(shè)定空白對照？

A14：在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測定450nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn))時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在不含細(xì)胞，加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。

Q15：哪些物質(zhì)會影響CCK-8的測定？

A15：當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時(shí)會影響CCK-8的測定，例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。

Q16：說明書上僅寫了96孔板的測定方法，如果使用24孔板或12孔板，應(yīng)該加多少量CC K-8試劑？

A16：一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10。

Q17：必須預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞嗎？

A17：不一定。如果要想保持細(xì)胞的最好狀態(tài)，建議預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。如果不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可能會不穩(wěn)定。也有人不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，但在做標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測時(shí)需要統(tǒng)一檢測條件。

Q18：如果加入的藥物中含有金屬，是否會有影響？

A18：金屬對CCK-8顯色有影響。終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm，將會100%抑制。

Q19：CCK-8試劑的保存條件？

A19：在避光條件下CCK-8試劑在4℃可保存一年。如果需要保存較長時(shí)間的話，推薦在-20℃下保存。但是CCK-8若反復(fù)解凍和冰凍將會增加空白吸收，從而影響檢測結(jié)果，若經(jīng)常使用可將試劑存放在4℃冰箱內(nèi)保存，分批使用建議分裝保存。

Q20：CCK-8對于不同的細(xì)胞，靈敏度是否一樣？

A20：不一樣，懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難染色。對于貼壁細(xì)胞，一般加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時(shí)吸光度已經(jīng)很高，但對于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的加入時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來解決。

Q21：有時(shí)在藥物作用情況下，細(xì)胞已經(jīng)死亡，但是脫氫酶的活性還在，是否能計(jì)算細(xì)胞數(shù)量？

A21：不能。由于CCK-8是通過和細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶進(jìn)行反應(yīng)間接反映活細(xì)胞數(shù)量，如果細(xì)胞已經(jīng)死亡，但脫氫酶的活性還在，則試劑測定的細(xì)胞數(shù)量將會比真實(shí)值高，不能真實(shí)反映活細(xì)胞數(shù)量，建議采用別的方法測定。

Q22：實(shí)驗(yàn)之前，是否需要先檢測一下培養(yǎng)基和CCK-8是否會反應(yīng)？

A22：需要，可用一個(gè)孔檢測一下，因?yàn)橛信囵B(yǎng)基中可能含有氧化還原反應(yīng)的物質(zhì)，在正式實(shí)驗(yàn)之前有必要先確認(rèn)培養(yǎng)基和CCK-8是否反應(yīng)。一般正常在的OD值應(yīng)該在0.4以下。

來源：“金沙生物”公眾號  
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