細胞培養(yǎng)又失敗了？保姆級細胞培養(yǎng)的詳細操作步驟來了！
發(fā)布時間：2023-03-21 瀏覽次數(shù)：540
細胞寶寶很嬌貴，無菌操作最重要。那么我們?nèi)绾螠蕚錈o菌環(huán)境呢？
01. 操作器械滅菌>>
移液管吸頭高壓滅菌（或購買事先經(jīng)過滅菌的移液管吸頭）。
70% 酒精對物品表面消毒。
02. 超凈工作臺或生物安全柜>>
將超凈工作臺窗扇關(guān)閉到合適位置，以保證空氣層流。
凈化工作區(qū)禁止堆放雜物，干擾潔凈氣流流動。
工作前消毒工作臺面，打開紫外燈消毒。工作結(jié)束后清理消毒臺面，并進行紫外消毒。
具有潛在感染性的材料需在生物安全柜中處理，禁止使用超凈工作臺。
03. 試劑無菌>>
所有培養(yǎng)基、添加劑和試劑必須無菌，防止細胞培養(yǎng)過程中微生物生長。如果某些試劑和添加劑未以無菌形式提供，則需要對其進行過濾除菌或高壓滅菌。此外，試劑需在無菌條件下配置和使用，以確保它們始終處于無菌狀態(tài)。
請記?。o菌操作貫穿細胞培養(yǎng)實驗始終！
接下來，我們要為細胞寶寶準備合適的食物。
細胞培養(yǎng)前，需要先查詢細胞系相關(guān)信息，以確定適合的培養(yǎng)基類型以及添加劑等。大多數(shù)細胞系可以使用MEM、 DMEM 培養(yǎng)基或RPMI等基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并要添加一定比例的胎牛血清（FBS）。
細胞寶寶還需要合適的環(huán)境，才能健康長大。
細胞培養(yǎng)需要控制細胞所處的溫度、pH、滲透壓、O2和CO2。
pH：大部分細胞在pH 7.4左右生長良好。
CO2：一般需要在專用的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)置為5% CO2。
溫度：大部分哺乳動物細胞培養(yǎng)溫度為37°C。禽類細胞在38.5°C生長最佳。昆蟲細胞最佳生長溫度是27°C。冷血動物細胞系可在15-26°C范圍內(nèi)培養(yǎng)。
細胞培養(yǎng)容器：大多數(shù)細胞系在專用的細胞培養(yǎng)瓶上生長，不需要特殊的基質(zhì)等。但一些細胞，特別是原代細胞，需要在特殊的基質(zhì)（如膠原蛋白）上生長，以促進細胞貼壁、分化或生長。建議查閱相關(guān)文獻，詳細了解您正在培養(yǎng)的細胞。
細胞寶寶很孤獨，我們需要每天去呵護哦。
每天用顯微鏡觀察細胞，以監(jiān)測其健康狀況、生長速度和融合度（單層細胞覆蓋的表面積百分比）。貼壁細胞應(yīng)主要附著在培養(yǎng)瓶底部，呈貼壁形態(tài)（取決于不同細胞系）。懸浮細胞應(yīng)呈圓形形態(tài)。一般可以把細胞形態(tài)分為三種基本形態(tài)：
含酚紅的培養(yǎng)基為粉紅色/橙色（培養(yǎng)基顏色會隨 CO 2 濃度發(fā)生變化）。含酚紅培養(yǎng)基呈淡黃色表示其pH 值降低呈酸性，通常與污染或細胞不健康有關(guān)。細胞成像實驗建議使用不含酚紅的培養(yǎng)基，避免干擾圖像采集。如果出現(xiàn)以下情況，請丟棄細胞：
細胞大量脫落（貼壁細胞系）和/或看起來干癟并呈顆粒狀/深色。
細胞處于停止生長狀態(tài)。
細胞寶寶需要一定的生活空間，太擁擠就需要搬家啦。
一般細胞融合度達到約 80%（即80% 的培養(yǎng)瓶表面被單層細胞覆蓋）時，即需要進行傳代培養(yǎng)。不建議細胞過度融合（達到100%）時傳代，因為這可能會影響細胞活性。
細胞傳代需要注意分板比/接種密度。不同的細胞系通常需要滿足特定的分板比/接種密度，務(wù)必查看所用細胞系的培養(yǎng)指南。生長較快的細胞可能需要高分板比（低接種密度），而生長緩慢的細胞可能需要低分板比（較高接種密度）。
如果細胞長時間無人看管（例如公共假日或周末），建議使用低于正常水平的分板比/接種密度。但是一些細胞，特別是原代細胞生長具有密度依賴性，過低的接種密度可能導致無法生長。
細胞分板比/接種密度需要通過對樣品中的細胞計數(shù)確定。細胞計數(shù)一般可使用血細胞計數(shù)板。
下面我再詳細說說細胞傳代的方法：
01. 貼壁細胞系>>
貼壁細胞一般需要使用胰蛋白酶等消化液，但其可能會損傷細胞，還可能會誘使某些膜蛋白暫時內(nèi)化，因此設(shè)計實驗時應(yīng)考慮到這一點。這時，可使用其他溫和消化試劑替代。以下是貼壁細胞傳代的一般步驟：
請注意：
PBS洗滌是為完全除去殘留的胎牛血清（FBS）、鈣和鎂等。必要時可多次洗滌（某些細胞系貼壁牢固，需多次沖洗才能徹底去除殘留 FBS），促進胰蛋白酶消化。
胰蛋白酶用量以覆蓋培養(yǎng)瓶底部為宜，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，確保消化液與所有細胞接觸。
將培養(yǎng)瓶放入 37 ℃ 培養(yǎng)箱中，更適合消化酶的消化。不同細胞消化時間不同，為避免因過度消化而嚴重破壞細胞，必須每隔幾分鐘進行一次檢查。
02. 半貼壁細胞系>>
一些細胞系介于懸浮和貼壁細胞之間，針對松散貼壁細胞，可不使用消化液，而使用移液管溫柔吹打，使細胞分散。以下是半貼壁細胞傳代的一般步驟：
03. 懸浮細胞系>>
懸浮細胞傳代難度略低于貼壁細胞，無需經(jīng)消化處理。以下是懸浮細胞傳代的一般步驟：
請注意：
一些懸浮細胞生長過程中可能結(jié)團，可添加 Pluronic PF68 等解離試劑使團塊分散。
懸浮細胞多次傳代后，細胞碎片和代謝廢物會不斷積累，可將細胞懸液以 100 × g離心 5 - 10 分鐘，棄去上清液，將細胞沉淀重懸在新鮮培養(yǎng)基中。
小貼士
細胞傳代需要注意細胞的傳代次數(shù)（細胞經(jīng)歷的傳代培養(yǎng)次數(shù)）。培養(yǎng)中應(yīng)記錄傳代次數(shù)，細胞代次過高，可能會發(fā)生遺傳漂變或其它變異，影響您的實驗。
低代次細胞，以及一些自己建立的特殊細胞系需要盡量多凍存幾管，以防細胞污染等情況造成您實驗中斷。
培養(yǎng)細胞是個精細活，要考慮到實驗的方方面面，才能得到理想狀態(tài)的細胞。最后一起看看細胞凍存、復(fù)蘇和細胞計數(shù)及存活測試!
01. 細胞凍存>>
目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由冰晶形成的細胞損傷。
10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌種保存很少用于細胞凍存。
取對數(shù)生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中。
離心1000 rpm,5 min.
去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細胞的最終密度為5x10^6/ml~1x10^7/ml.
在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者。
凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/min；當溫度達到-25℃以下時，可增至-5℃~-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。
02. 細胞復(fù)蘇>>
從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。
從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。
離心，1000 rpm，5 min。
棄去上層清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
03. 細胞計數(shù)和存活測試>>
原理：
(1) 計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。
(2) 血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細胞數(shù)目。
(3) 存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。計算細胞活率：活細胞數(shù)/(活細胞數(shù)+死細胞數(shù))×100%。計數(shù)應(yīng)在臺盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時間延長，部分活細胞也開始攝取染料;因為臺盼蘭對蛋白質(zhì)有很強的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計數(shù)更為準確。
材料：0.4%w/v trypan blue;Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球計數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip);計數(shù)器(counter);低倍倒立顯微鏡;粒子計數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白細胞稀釋液(4%乙酸溶液)。
步驟：
(1)取50μl細胞懸浮液與50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。
(2)取少許混合液(約15μl)自血球計數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色(或紅色-Erythrosin bluish)。
(3)計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合)，最后乘以104，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數(shù)。若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。
注：4大格細胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4=細胞數(shù)/ml;每一大格的體積=2.5px×2.5px×0.25px=10-4ml
計數(shù)板計數(shù)時，最適濃度為5～10×105細胞/ml，此范圍外計數(shù)誤差偏大。高濃度細胞懸液，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計數(shù)。
小貼士
冷凍越慢越好，復(fù)蘇越快越好
操作人員在接觸液氮罐時應(yīng)戴防護面罩、防護手套，穿防護衣，防止凍存管或氣體爆裂對人體造成傷害。在存放液氮罐的房間中也應(yīng)裝有檢測氣體濃度的報警裝置，防止人員暈厥的現(xiàn)象發(fā)生。大家在做實驗的時候一定要小心操作、注意安全。
凍存細胞數(shù)量要足夠，一般最低要達到5x10^6/ml。濃度視情況而定。
做好標記：培養(yǎng)瓶上應(yīng)該用馬克筆做好標記，寫上細胞名稱、代數(shù)和凍存時間。
對剛復(fù)蘇的細胞動作要輕柔，避免細胞破裂。
DMSO對大多數(shù)細胞不敏感，所以解凍之后不需要除去DMSO，解凍后頻繁換液會慢慢除去DMSO。部分對DMSO敏感的細胞需要除去DMSO。
解凍后的細胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清，突然換不一樣的培養(yǎng)液和血清會造成細胞生長不良，甚至死亡。
下面這些凍存和復(fù)蘇遇到的坑請注意：
1 復(fù)蘇時遇到凍存時挖的坑
實驗室偶爾也會發(fā)生這樣的情況：“靠，細胞要死了，趕緊凍掉，不能讓細胞死在我手里。”“天呢，細胞培養(yǎng)液都這么黃了，趕緊凍掉?！薄皨屟?，細胞融合度都逼近100%了，趕緊凍掉?！薄斑?，細胞好像少了點，算了，就這樣吧?！比绻銖?fù)蘇的細胞就是上面這些人所留下來的，那就要格外注意了。
解決方法：所謂知己知彼才能百戰(zhàn)不殆，在復(fù)蘇前，一定要先清楚地了解這份細胞的增殖能力。如果增殖能力不高，接種時就要增加細胞接種密度并添加5%~10%的血清。如果細胞本身數(shù)量就非常少，也可以不離心，直接接種培養(yǎng)（加入培養(yǎng)基的體積＞5倍的凍存細胞體積）。復(fù)蘇后3天內(nèi)盡量少對細胞進行操作，延遲換液時間。
2 無孔不入的微生物
做實驗就像走鋼絲，稍不留神就會跌進充滿微生物的沼澤中不能自拔。
解決辦法：凍存時，一定要擰緊凍存管的蓋子，否則水浴復(fù)蘇的時候，水浴鍋中的水就會滲入到凍存管中去，造成細胞的污染并會使那些低免疫力的接受移植的患者產(chǎn)生嚴重的感染。
3 細胞非正?！皬?fù)蘇”
那是一個安靜的下午，大家都在專心地做著實驗，突然聽到有人大叫“這是誰的細胞，一直放在外面，都化了。”原來剛才同事取細胞的時候，把整個凍存架都拿了出來，后來居然忘記再把它放回液氮罐中。而此時細胞們已經(jīng)無一幸免地 “融化了”。
解決辦法：馬上種瓶，千萬不要把這些細胞繼續(xù)放回液氮罐中凍存。此時細胞內(nèi)已經(jīng)有大量的冰晶形成，細胞膜已經(jīng)受到損傷，如果離心就會造成細胞膜完全破碎、細胞立即死亡的后果。所以切記不要離心，而應(yīng)直接種瓶，也不要進行吹打，只輕輕搖晃。培養(yǎng)時加入10%的血清，種瓶后48h內(nèi)都不要對細胞進行操作。這是一個真實的案例，后來在大家的努力下，那些增殖能力本來就旺盛的細胞還是活了下來。
備注：本辦法也同樣適用于那些停電后造成超低溫冰箱升溫（一般升溫到-40℃時就要小心了）的情況。
4 拿錯了細胞，養(yǎng)了別人家的“孩子”
電視劇里抱錯孩子的狗血劇情也同樣會發(fā)生在實驗室中。學校的液氮罐基本上都是公用的，所以如果樣本標記不詳就會發(fā)生拿錯的情況。
解決辦法：每支凍存管上都應(yīng)用凍存專用的記號筆詳細標記上細胞名稱、凍存時間、樣本批號等信息并將這些信息詳細記錄在冊。存放細胞時，最好規(guī)定每個人的存放位置，免得下次找細胞的時候非要把整個液氮罐翻個底朝天才找得到。復(fù)蘇拿取細胞時，也應(yīng)在對應(yīng)的存放位置處進行查找，找到對應(yīng)的細胞后應(yīng)核查記錄冊上的信息是否與凍存管上的細胞名稱、凍存時間、樣本批號一致。
5 安全第一，細胞第二
凡是和液氮接觸的操作，都應(yīng)該注意安全。小編的同事Z就在一次打開液氮罐蓋子的時候被氣體沖擊了眼睛，導致眼睛當場流血，不過后來經(jīng)過醫(yī)治已經(jīng)沒有什么大礙了。還有小編的同事L在前單位工作時有一次在樣本保存室里突然暈倒了（估計是液氮罐漏氣所致）。
解決辦法：操作人員在接觸液氮罐時應(yīng)戴防護面罩、防護手套，穿防護衣，防止凍存管或氣體爆裂對人體造成傷害。在存放液氮罐的房間中也應(yīng)裝有檢測氣體濃度的報警裝置，防止人員暈厥的現(xiàn)象發(fā)生。大家在做實驗的時候一定要小心操作、注意安全。
6 如何讓凍存的組織滿血復(fù)活
很多時候我們都會遇到組織復(fù)蘇培養(yǎng)的成功率低、長勢慢的情況，這到底是哪里出錯了呢？
解決辦法：
（1）組織要剪得足夠??；
（2）程序降溫盒不要立馬放入-80℃冰箱中，應(yīng)先置于4℃冰箱內(nèi)15min~30min；
（3）凍存液的體積應(yīng)至少是組織體積的2~3倍；
（4）組織復(fù)蘇后進行培養(yǎng)時，應(yīng)在培養(yǎng)基中加入5%～10%的血清。
7 復(fù)蘇后，細胞不見起色就扔掉？！
復(fù)蘇2~3天后，認為細胞沒有明顯增殖就扔掉細胞，但其實有些細胞需要復(fù)蘇一周后才會發(fā)生明顯的變化。
解決辦法：如果復(fù)蘇培養(yǎng)3天后細胞仍不見增殖，先不要著急換液。試著補加血清、細胞因子，等一周后再看細胞增殖情況再定。
8 心急凍不了好細胞
凍存時，不要將細胞放入剛剛從-80℃冰箱中取出的程序降溫盒內(nèi)（此時盒內(nèi)的異丙醇還是凍住的）。這樣會導致細胞在一開始的時候就進入低溫狀態(tài)，影響細胞復(fù)蘇后的存活率。
解決辦法：將程序降溫盒提前拿至室溫中，使細胞可以從室溫降至-80℃。
常規(guī)的程序降溫盒中是填充了異丙醇的，所以能夠以每分鐘一度的速度進行降溫。但是異丙醇屬于有毒溶劑，又容易揮發(fā)，長期使用不但會對環(huán)境造成污染也對實驗人員的安全有不利影響。推薦一款新的細胞程序降溫盒，不需要填充異丙醇就可以正常工作，而且很容易打開蓋子，方便拿取。
轉(zhuǎn)自：abcam、 中洪博元醫(yī)學實驗幫、解螺旋
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