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CCK-8檢測原理、優(yōu)勢及注意事項大盤點

發(fā)布時間：2022-12-12    瀏覽次數(shù)：1102

CCK8是Cell Counting Kit-8縮寫，直譯為：細(xì)胞計數(shù)試劑。WST-8用于測定細(xì)胞增殖和毒性分析。

CCK-8檢測原理

WST-8在電子耦合試劑1-Methoxy PMS存在的情況下，可以被細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物。顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450mM波長處測定OD值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。

檢測方法 MTT法XTT法WST-1法CCK-8法
甲臜產(chǎn)物的水溶性 差（需加有機(jī)溶劑溶解再檢測）好好好
產(chǎn)品形狀 粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液
使用方法 配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用即開即用即開即用
檢測靈敏度 高很高很高高
檢測時間 較長較短較短最短
檢測波長 560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm
細(xì)胞毒性 高，細(xì)胞形態(tài)完全消失很低，細(xì)胞形態(tài)不變很低，細(xì)胞形態(tài)不變很低，細(xì)胞形態(tài)不變
試劑穩(wěn)定性 一般較差一般很好
批量樣品檢測 可以非常適合非常適合非常適合
便捷程度 一般便捷便捷非常便捷

表1 CCK法與其他細(xì)胞增殖/毒性檢測方法的優(yōu)勢比較


相比之下，CCK-8的甲臜產(chǎn)物水溶性好，無需現(xiàn)配現(xiàn)用，靈敏度高，檢測時間最短，試劑穩(wěn)定性好，可實現(xiàn)批量檢測，加上酚紅和血清對CCK-8法的檢測不會造成干擾，而且CCK-8的細(xì)胞毒性非常低，加入CCK-8顯色后，可以在不同時間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀數(shù)從而找到最佳測定時間，因此CCK-8法成為細(xì)胞增殖測定的首選方法。

注意事項：

  1. 細(xì)胞鋪板：鋪板時需不?；靹蚣?xì)胞懸液，這樣每孔細(xì)胞的接種密度的誤差才會小。建議每隔12個孔左右吹打混勻一次細(xì)胞懸液。

  2. CCK-8添加時間問題：雖然建議種板4小時后細(xì)胞貼壁即可添加CCK-8，但是細(xì)胞忽然換了環(huán)境，4個小時細(xì)胞狀態(tài)可能還不夠穩(wěn)定，如果過早添加CCK-8，由于細(xì)胞狀態(tài)不穩(wěn)定容易導(dǎo)致實驗結(jié)果的可重復(fù)性差，所以可以采取種板過夜后添加CCK-8方法。

  3. 細(xì)胞的接種密度問題：通常建議每孔3-8千個細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)過少或過密都會對細(xì)胞狀態(tài)有影響。一般以顯微鏡下每孔密度大約為75-80%的時候加藥，該密度下結(jié)果更為穩(wěn)定。如果接種細(xì)胞數(shù)量過少，也可以在板中孵育細(xì)胞密度至80%左右再加藥。

  4. CCK8試劑與細(xì)胞培養(yǎng)基混勻的問題：考慮到孵育時每孔蒸發(fā)量不一樣，所以在加CCK8時，應(yīng)該將舊的培養(yǎng)基吸出，加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基與CCK8混勻液（100：10）進(jìn)行檢測。