循序漸進(jìn)地細(xì)胞馴化，有效達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)的最終目標(biāo)
發(fā)布時(shí)間：2022-08-17 瀏覽次數(shù)：1195
不論是多重實(shí)驗(yàn)條件的測(cè)試，或是以細(xì)胞量/產(chǎn)物量放大為目的，對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)，通常會(huì)是環(huán)境變異的大考驗(yàn)，因而導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)/活性/表現(xiàn)可能不如預(yù)期。為了把握每一次的實(shí)驗(yàn)，一般建議進(jìn)行循序漸進(jìn)的條件轉(zhuǎn)換，也就是小幅度變化的條件改變，這個(gè)過(guò)程稱作”細(xì)胞馴化”。舉例來(lái)說(shuō)，想降低培養(yǎng)基中血清做測(cè)試時(shí)，將原來(lái)血清 20%的比例，下降為 15%，確認(rèn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況穩(wěn)定后，再降為10%去測(cè)試觀察，這就是小幅度的條件改變。
馴化狀況的評(píng)估與觀察建議是以 2 代細(xì)胞為區(qū)間，其中包含幾個(gè)基本建議：
1. Cell viability > 90% 維持 2 代再轉(zhuǎn)換測(cè)試條件。
2. 觀察 Doubling time 隨代數(shù)的變動(dòng)，若以同樣條件連續(xù) 2 代都不斷延長(zhǎng)，則可能需要以最初的原有條件培養(yǎng)，并增加該細(xì)胞所需的專一營(yíng)養(yǎng)物。反之，若是在細(xì)胞型態(tài)上不改變的情況下，慢1-2 小時(shí)則建議以相同的培養(yǎng)條件再看 1 代細(xì)胞，此時(shí)若 doubling time 不再增加，則表示已初步抓到一個(gè)適合的條件。
3. 以高于一般繼代時(shí)的細(xì)胞數(shù)完成 seeding，并且每一次繼代培養(yǎng)時(shí)都是。舉例來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)室平常培養(yǎng)時(shí)，是 seeding 3-5x10^5 cells/ml，做馴化測(cè)試時(shí)則提高到 1-2x10^6 cells/ml，且以同樣的細(xì)胞數(shù)繼代到第 2 代。當(dāng)連續(xù) 2 代 viability 都維持 90%以上，且要以相同條件繼續(xù)測(cè)時(shí)，可以下降細(xì)胞數(shù)/若要再換另一條件，則仍 seeding 較高的 1-2x10^6 cells/ml。
4. Morphology 觀察上，若僅為微小的變化，而 Doubling time/Cell viability 維持良好，則觀察2 代后，仍可以再進(jìn)行下一階段的條件測(cè)試。
5. 每隔 2 代的馴化后細(xì)胞建議都進(jìn)行凍存，若是已知較為敏感的細(xì)胞，則建議觀察至少 3 代再做保存與下一階段的測(cè)試。
馴化的概念，其實(shí)也可以應(yīng)用在一些初步的測(cè)試上，例如細(xì)胞實(shí)驗(yàn)常會(huì)做血清測(cè)試，當(dāng)使用不同來(lái)源的血清時(shí)，因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)豐富度可能并非完全相同，所以細(xì)胞在測(cè)試的第 1 代時(shí)，可能會(huì)有 doublingtime 改變的狀況，一般到第 2 代培養(yǎng)時(shí)就會(huì)接近原來(lái)的培養(yǎng)狀態(tài)。另外，在以細(xì)胞進(jìn)行的制程上，例如抗體、蛋白藥生產(chǎn)，都會(huì)在制程規(guī)劃的階段進(jìn)行馴化測(cè)試，穩(wěn)定細(xì)胞的培養(yǎng)狀況并且優(yōu)化成專門產(chǎn)生特定產(chǎn)物的條件。
將在制程上直接應(yīng)用，或是未來(lái)打算往制程方面發(fā)展時(shí)，在前期馴化時(shí)就會(huì)使用非動(dòng)物性來(lái)源(Animal-derived component free，ADCF)的材料，因此一般細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，會(huì)用到的豬來(lái)源trypsin（胰蛋白酶） 可能就會(huì)以 ADCF 等級(jí)的 細(xì)胞解離試劑 取代(重組蛋白酵素，對(duì)細(xì)胞溫和且具有與豬來(lái)源 trypsin相同效能)；使用 ADCF 等級(jí)的 細(xì)胞培養(yǎng)凍存液將馴化好的細(xì)胞長(zhǎng)期保存；使用 Serum-free medium (SFM)進(jìn)行制程培養(yǎng)，每一批次產(chǎn)程皆穩(wěn)定。
