循序漸進(jìn)地細(xì)胞馴化，有效達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)的最終目標(biāo)
發(fā)布時間：2022-08-17 瀏覽次數(shù)：1196
不論是多重實驗條件的測試，或是以細(xì)胞量/產(chǎn)物量放大為目的，對于細(xì)胞來說，通常會是環(huán)境變異的大考驗，因而導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)/活性/表現(xiàn)可能不如預(yù)期。為了把握每一次的實驗，一般建議進(jìn)行循序漸進(jìn)的條件轉(zhuǎn)換，也就是小幅度變化的條件改變，這個過程稱作”細(xì)胞馴化”。舉例來說，想降低培養(yǎng)基中血清做測試時，將原來血清 20%的比例，下降為 15%，確認(rèn)細(xì)胞生長狀況穩(wěn)定后，再降為10%去測試觀察，這就是小幅度的條件改變。
馴化狀況的評估與觀察建議是以 2 代細(xì)胞為區(qū)間，其中包含幾個基本建議：
1. Cell viability > 90% 維持 2 代再轉(zhuǎn)換測試條件。
2. 觀察 Doubling time 隨代數(shù)的變動，若以同樣條件連續(xù) 2 代都不斷延長，則可能需要以最初的原有條件培養(yǎng)，并增加該細(xì)胞所需的專一營養(yǎng)物。反之，若是在細(xì)胞型態(tài)上不改變的情況下，慢1-2 小時則建議以相同的培養(yǎng)條件再看 1 代細(xì)胞，此時若 doubling time 不再增加，則表示已初步抓到一個適合的條件。
3. 以高于一般繼代時的細(xì)胞數(shù)完成 seeding，并且每一次繼代培養(yǎng)時都是。舉例來說，實驗室平常培養(yǎng)時，是 seeding 3-5x10^5 cells/ml，做馴化測試時則提高到 1-2x10^6 cells/ml，且以同樣的細(xì)胞數(shù)繼代到第 2 代。當(dāng)連續(xù) 2 代 viability 都維持 90%以上，且要以相同條件繼續(xù)測時，可以下降細(xì)胞數(shù)/若要再換另一條件，則仍 seeding 較高的 1-2x10^6 cells/ml。
4. Morphology 觀察上，若僅為微小的變化，而 Doubling time/Cell viability 維持良好，則觀察2 代后，仍可以再進(jìn)行下一階段的條件測試。
5. 每隔 2 代的馴化后細(xì)胞建議都進(jìn)行凍存，若是已知較為敏感的細(xì)胞，則建議觀察至少 3 代再做保存與下一階段的測試。
馴化的概念，其實也可以應(yīng)用在一些初步的測試上，例如細(xì)胞實驗常會做血清測試，當(dāng)使用不同來源的血清時，因為營養(yǎng)豐富度可能并非完全相同，所以細(xì)胞在測試的第 1 代時，可能會有 doublingtime 改變的狀況，一般到第 2 代培養(yǎng)時就會接近原來的培養(yǎng)狀態(tài)。另外，在以細(xì)胞進(jìn)行的制程上，例如抗體、蛋白藥生產(chǎn)，都會在制程規(guī)劃的階段進(jìn)行馴化測試，穩(wěn)定細(xì)胞的培養(yǎng)狀況并且優(yōu)化成專門產(chǎn)生特定產(chǎn)物的條件。
將在制程上直接應(yīng)用，或是未來打算往制程方面發(fā)展時，在前期馴化時就會使用非動物性來源(Animal-derived component free，ADCF)的材料，因此一般細(xì)胞培養(yǎng)時，會用到的豬來源trypsin（胰蛋白酶） 可能就會以 ADCF 等級的 細(xì)胞解離試劑 取代(重組蛋白酵素，對細(xì)胞溫和且具有與豬來源 trypsin相同效能)；使用 ADCF 等級的 細(xì)胞培養(yǎng)凍存液將馴化好的細(xì)胞長期保存；使用 Serum-free medium (SFM)進(jìn)行制程培養(yǎng)，每一批次產(chǎn)程皆穩(wěn)定。
