中國工程院食品安全院士團(tuán)隊

科研成果轉(zhuǎn)化平臺

食品安全一直是全球關(guān)注的焦點，尤其是由食源性病原體引發(fā)的疾病，不僅對人類健康構(gòu)成威脅，還給社會經(jīng)濟(jì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。其中，大腸桿菌O157:H7（E. coli O157:H7）因其能夠產(chǎn)生志賀毒素，引發(fā)嚴(yán)重的血性腹瀉、腎衰竭甚至死亡，成為食品安全領(lǐng)域的重要檢測目標(biāo)。傳統(tǒng)的檢測方法如平板培養(yǎng)法操作繁瑣且耗時長，無法滿足快速檢測的需求。盡管聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和等溫擴(kuò)增技術(shù)在一定程度上提高了檢測效率，但仍需復(fù)雜的樣品前處理步驟。因此，開發(fā)一種快速、靈敏且操作簡便的檢測方法顯得尤為重要。

近日，來自中南林業(yè)科技大學(xué)的研究團(tuán)隊在《Biosensors and Bioelectronics》期刊上發(fā)表了一項突破性研究，提出了一種基于噬菌體M13誘導(dǎo)的“一對多”熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）傳感器，用于高效檢測大腸桿菌O157:H7。該傳感器不僅具有極高的靈敏度，檢測限低至6 CFU/mL，還在選擇性、檢測時間、準(zhǔn)確性和存儲穩(wěn)定性方面表現(xiàn)出色，為食品安全、環(huán)境監(jiān)測和醫(yī)學(xué)診斷提供了強(qiáng)有力的工具。

FRET技術(shù)的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是一種高效的檢測技術(shù)，能夠通過能量從供體熒光分子向受體熒光分子的轉(zhuǎn)移來實現(xiàn)精確的定量分析。FRET技術(shù)具有抗背景熒光干擾和環(huán)境干擾的能力，因此在復(fù)雜樣品中的應(yīng)用前景廣闊。然而，傳統(tǒng)的FRET技術(shù)存在一個顯著的限制：每個識別事件只能觸發(fā)一次FRET（“一對一”信號模式），這限制了其在痕量目標(biāo)檢測中的靈敏度。

為了克服這一限制，研究團(tuán)隊提出了“一對多”信號放大策略。通過利用噬菌體M13的結(jié)構(gòu)特性，研究團(tuán)隊成功實現(xiàn)了單個識別事件觸發(fā)多次FRET，從而顯著提高了檢測靈敏度。

“一對多”FRET傳感器的構(gòu)建與工作原理

研究團(tuán)隊利用磁性微球（MBs）作為捕獲探針，將特異性識別大腸桿菌O157:H7的適配體固定在磁性微球表面，用于從食品樣品中分離目標(biāo)細(xì)菌。隨后，功能化的噬菌體O157S-M13K07-SBP作為檢測探針，與目標(biāo)細(xì)菌結(jié)合。由于P8蛋白的N端距離精確固定，鏈霉親和素標(biāo)記的FRET供體（SA-QD460）和受體（SA-QD620）可以通過SBP與SA的結(jié)合固定在噬菌體表面，形成FRET探針。每個噬菌體表面可以發(fā)生約605次FRET事件，從而實現(xiàn)了信號放大。

圖1 A. M13噬菌體的結(jié)構(gòu)。M13外表面黃色突出顯示的氨基酸殘基代表N端丙氨酸，鏈霉親和素結(jié)合肽（SBP）即插入此處。B.通過兩步定點誘變構(gòu)建O157S-M13K07-SBP噬菌體載體。C. O157S-M13K07-SBP誘導(dǎo)并放大的用于高靈敏度檢測大腸桿菌O157:H7的FRET傳感器示意圖。

傳感器的性能評估

研究團(tuán)隊對該傳感器的性能進(jìn)行了全面評估。實驗結(jié)果表明，該傳感器在PBS、牛奶、豬肉和生菜樣品中對大腸桿菌O157:H7的檢測限分別為6 CFU/mL、15 CFU/mL、18 CFU/mL和17 CFU/mL，線性范圍從5.9×10¹到5.9×10⁸ CFU/mL。此外，該傳感器在選擇性、準(zhǔn)確性和存儲穩(wěn)定性方面也表現(xiàn)出色。即使在儲存一個月后，F(xiàn)RET信號仍保持在80%以上，顯示出良好的長期穩(wěn)定性。

圖2 A.噬菌體誘導(dǎo)的福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）傳感器的選擇性。利用FRET探針（O157S-M13K07-QD460/620）中的QD620對熒光信號進(jìn)行定量分析。大腸桿菌O157:H7（ATCC43888）的濃度為5.9×10⁴ CFU/mL，其他細(xì)菌濃度為10⁵ CFU/mL，牛血清白蛋白（BSA）濃度為0.1%，單價離子濃度為100 mM，二價離子濃度為20 mM。B. FRET探針O157S-M13K07–QD460/QD620的儲存穩(wěn)定性。每個數(shù)據(jù)均為3個獨立樣本的平均值（n=3）。

實際應(yīng)用與前景

為了驗證該傳感器的實際應(yīng)用能力，研究團(tuán)隊在牛奶、生菜、豬肉和湖水樣品中進(jìn)行了加標(biāo)回收實驗。結(jié)果顯示，回收率在82.3%至119.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.0%至9.2%之間，表明該傳感器在實際樣品中具有高準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

圖3 利用噬菌體誘導(dǎo)的FRET傳感器對大腸桿菌O157:H7進(jìn)行定量檢測。圖中展示了在牛奶、豬肉和生菜中檢測濃度為5.9×（1、10、10²、103、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸）CFU/mL的大腸桿菌O157:H7時的熒光光譜（A、C、E）以及相應(yīng)的FRET信號（E%）（B、D、F）。每個數(shù)據(jù)點均為3個獨立樣本的平均值（n=3）。誤差棒表示3次測量的標(biāo)準(zhǔn)差。

這項研究的成功不僅為大腸桿菌O157:H7的檢測提供了一種高效、靈敏的新方法，還為FRET傳感器的設(shè)計開辟了新的思路。通過修改P3蛋白上的識別肽，該平臺可以進(jìn)一步應(yīng)用于其他目標(biāo)物的檢測，如其他病原菌、環(huán)境污染物或生物標(biāo)志物。

結(jié)論

這項研究展示了噬菌體M13在FRET傳感器中的巨大潛力。通過“一對多”信號放大策略，研究團(tuán)隊成功開發(fā)了一種高靈敏度、高選擇性的FRET傳感器，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測食品和環(huán)境樣品中的大腸桿菌O157:H7。這一技術(shù)的推廣應(yīng)用將為食品安全和公共衛(wèi)生領(lǐng)域帶來深遠(yuǎn)影響，并為未來的生物傳感器設(shè)計提供新的方向。

隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，我們有理由相信，基于噬菌體的FRET傳感器將在更多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，為人類健康和環(huán)境保護(hù)提供更加可靠的保障。

參考文獻(xiàn)：Meng M, Ma X, Yu L, et al. Phage-induced “one-to-many” FRET sensor for highly sensitive detection of Escherichia coli O157: H7[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2024, 264: 116661.

來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~蔡偉程。