中國工程院食品安全院士團隊

科研成果轉化平臺

大腸桿菌（Escherichia coli, E. coli）是導致75%尿路感染的元兇，包括膀胱炎和急性腎盂腎炎，這是一種常見的細菌感染性疾病，對公共健康構成威脅。早期準確檢測大腸桿菌對于控制病程和改善患者治療至關重要。這需要一種具有高靈敏度和特異性的檢測方法，以應對疾病早期階段靶標的低豐度。盡管聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）作為病原體檢測的金標準滿足這些要求，但其缺點如操作復雜和儀器昂貴，限制了其在資源匱乏地區(qū)的初步診斷應用。

即時檢測（point of care testing, POCT）由于其便攜性、一次性、設置簡便以及操作簡單，已成為實驗室外診斷檢測的重要工具。紙基設備是POCT的理想候選者，因為它們具有輕便、一次性、兼容性和低成本等特性。迄今為止，各種紙基POCT設備已經廣泛用于檢測病原菌，如幽門螺桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、嗜酸乳桿菌等。其中，最流行的紙基設備是比色檢測，這種方法可以實現快速且可視化的POCT。然而，這些設備通常面臨靈敏度不足的問題。引入信號放大策略是提高靈敏度的常用方法，然而，這增加了成本并延長了分析時間。因此，開發(fā)一種無需擴增的、能夠快速且高度靈敏地檢測大腸桿菌的紙基POCT設備是非常必要的。

裂解RNA的DNA酶（RNA-cleaving DNAzymem, RCD）是一種經典的DNA催化劑，能夠進行目標響應的RNA底物裂解。大多數通過體外選擇獲得的細菌特異性RCD需要二價金屬離子的輔助，在中性pH條件下裂解RNA/DNA嵌合底物。這可能導致外源核酸酶的非特異性降解，從而產生假陽性結果

近日，大連理工大學環(huán)境學院Meng Liu團隊在Chem Comm期刊上發(fā)表了題為：Amplification-free detection of Escherichia coli using an acidic deoxyribozyme-based paper device論文。

為了解決該問題，開發(fā)了一種由大腸桿菌激活的酸性RCD（acidic RCD, aRCD-EC1），該酶只需要一價金屬離子作為輔因子，并且在pH值為5.3的條件下表現出更高的催化活性。aRCD-EC1能夠在10 min內檢測到低至10⁴ CFU/mL的大腸桿菌。先前研究表明，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）通常用于比色反應，并且在酸性條件下表現出最佳的催化性能。基于上述結果，開發(fā)一種與HRP連接的aRCD-EC1檢測方法，可能實現無擴增條件下的大腸桿菌的高靈敏度檢測。

工作原理如圖1所示。aRCD-EC1在5'端被修飾有DNA延伸序列，用于與HRP標記的DNA探針進行雜交，并在3'端與生物素修飾，以通過鏈霉親和素–生物素相互作用固定在瓊脂糖珠子上。在大腸桿菌存在的情況下，MaRCD-EC1可以被激活，催化形成的HRP@MaRCD-EC1/珠子的裂解。隨后，釋放的包含HRP的DNA探針可以分離出來，用于在酸性條件下進行H?O?介導的3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine, TMB）的氧化反應，生成藍色產物。因此，大腸桿菌的檢測可以通過檢測HRP的釋放來實現。

圖1 用于大腸桿菌視覺檢測的HRP@MaRCD-EC1/beads示意圖。

我們首先采用dPAGE分析在pH5.3條件下測試了MaRCD-EC1的裂解活性（圖2a）。在大腸桿菌粗細胞內混合物（crude intracellular mixture derived from E. coli, CIM-EC）存在的情況下，MaRCD-EC1表現出表觀速率常數(k_obs)為0.11 min?1，低于aRCD-EC1的k_obs（1.18 min?1），30 min后在25°C下的裂解產率為89.2%（圖2b）。隨后，我們測試了MaRCD-EC1對非特異性病原體的CIM反應，包括肺炎克雷伯氏菌（K. pneumoniae）、金黃色葡萄球菌（S. aureus）、銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）、角膜炎假單胞菌（B. gladioli）、蠟狀芽孢桿菌（B. cereus）和枯草芽孢桿菌（B. subtilis）。未觀察到裂解產物，表明MaRCD-EC1具有高度特異性（圖2c）。通過加入不同濃度的CIM-EC研究其靈敏度。結果顯示，MaRCD-EC1可以在30 min內檢測到低至10² CFU/mL的E. coli，展示了其高靈敏度。顯然，RCD-EC1 3'端的生物素修飾僅延長了分析時間，對MaRCD-EC1的選擇性和靈敏度幾乎沒有影響。綜上所述，這些結果為開發(fā)用于大腸桿菌檢測的高靈敏度比色探針奠定了基礎。

圖2 (a) MaRCDs的工作原理是通過與CIM-EC中的目標結合激活，不依賴M2?離子。F表示熒光素標記的dT，R表示腺苷核糖核苷酸。(b) MaRCD-EC1S在25°C下對CIM-EC的動力學響應，圖中給出了k_obs值。(c) MaRCD-EC1對來自不同細菌的CIM的響應，包括克雷伯氏肺炎菌（KP）、金黃色葡萄球菌（SA）、銅綠假單胞菌（PA）、角膜炎假單胞菌（BG）、蠟樣芽孢桿菌（BC）、枯草芽孢桿菌（BS）和大腸桿菌（EC）。M =marker，Unclv =未裂解，Clv =已裂解，NC =陰性對照，%Clv = 裂解百分比，計算公式為：%Clv = (clv × 100) / (clv + unclv)，其中clv為已裂解條帶的體積，unclv為未裂解條帶的體積。(d) 在25°C下反應30 min后，10% dPAGE分析MaRCD-EC1對從10–10? CFU/mL大腸桿菌細胞制備的CIM-EC的響應。

我們接著研究了HRP在不同pH值下的催化活性。如圖3a所示，HRP在弱酸性環(huán)境（pH 5-6）中表現出最高的活性，這與MaRCD-EC1裂解緩沖液相容。通過簡單的離心將釋放的HRP從瓊脂糖珠中分離出來，并向上清液中加入TMB和H?O?混合物進行比色測定。根據比色反應的k_obs與HRP濃度之間的線性關系，可以計算出不同反應時間下釋放的HRP比例。在CIM-EC存在的情況下，隨著MaRCD-EC1裂解反應時間的增加，釋放的HRP量逐漸增加，并在30 min內達到平臺期（圖3b）。相反，在沒有CIM-EC的情況下，沒有觀察到HRP的釋放。

研究人員還研究了基于HRP@MaRCD-EC1/珠子的生物傳感器的傳感性能。如圖3c、e所示，當測試來自克雷伯氏肺炎菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、角膜炎假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的CIM時，未觀察到明顯的比色信號。通過使用不同濃度的大腸桿菌（10–10⁷ CFU/mL）制備的CIM對比色法的靈敏度進行了測試。結果表明，該方法可以檢測到低至10² CFU/mL的大腸桿菌（圖3d）。比色信號強度與大腸桿菌濃度相關，使其能夠實現半定量的比色檢測。綜上所述，這些結果表明，將HRP@MaRCD-EC1固定在瓊脂糖珠上對傳感性能幾乎沒有影響。

圖3 (a) 不同pH值下HRP的催化活性。(b) 在沒有和存在CIM-EC的情況下珠子中HRP的動力學釋放。(c) 在不同細菌存在下的相對顏色強度分析。相對顏色強度表示為 I/I₀，其中I是t = 6 min時的顏色強度，I₀是存在CIM-EC時的顏色強度。(d) 在不同濃度的CIM-EC存在和不存在的情況下HRP的釋放動力學。S/B = 信號與背景比。(e) 在不同細菌CIM存在下HRP@MaRCD-EC1-珠子溶液的上清液圖像。(f) 在不同濃度的CIM-EC下HRP@MaRCD-EC1-珠子溶液的上清液圖像。

在將瓊脂糖珠通過pullulan固定在紙張表面后，我們開發(fā)了一種基于HRP@MaRCD-EC1的紙基傳感器，用于大腸桿菌的比色檢測。該紙基傳感器具有三個區(qū)域（圖4a）：左側的傳感區(qū)（Z1）包含用于靶標識別的HRP@MaRCD-EC1，中間區(qū)域（Z2）覆蓋有5%（w/v）的pullulan薄膜，用于控制液體的流速，右側檢測區(qū)（Z3）含有用于信號輸出的TMB。這三個區(qū)域通過蠟屏障印制在背襯為塑料的Whatman濾紙（1號）上。操作步驟如下：在典型測試中，將50 μL的CIM-EC加入Z1進行靶標識別，并裂解RNA底物以釋放HRP。經過30 min的反應，Z2處的pullulan薄膜會溶解，允許溶液流向Z3。由于瓊脂糖珠的平均直徑為100 μm，明顯大于Whatman濾紙的平均孔徑（11 μm），因此瓊脂糖珠無法通過毛細力驅動流動，只有釋放的HRP可以流向Z3，在H?O?的存在下氧化TMB，從而產生比色信號。

我們首先通過該紙基設備對大腸桿菌進行了可視化檢測，并驗證了其可行性。在HRP、MaRCD-EC1和CIM-EC的存在下，生成了顏色信號。結果表明，裝置上的HRP@MaRCD-EC1/珠子能夠特異性識別大腸桿菌并釋放HRP以進行比色反應。隨后，利用不同來源的CIM評估了裝置的特異性，未觀察到顏色信號（圖4b），表明其特異性較高。此外，我們發(fā)現顏色強度與大腸桿菌的濃度呈正相關，范圍從10²到10⁷ CFU/mL（圖4c）。在30 min內，該設備實現了10² CFU/mL的檢測限。值得注意的是，與未采用擴增過程的報道紙基設備相比，該設備提供了更高的靈敏度（檢測限為10² CFU/mL）和更短的樣品處理時間（30 min）。

圖4 (a) 紙基裝置的設計及其工作原理。Z1為感應區(qū)，Z2為閥門區(qū)，Z3為檢測區(qū)。(b) 紙基裝置對不同細菌反應的平均光密度值。插圖：在添加圖中指示的細菌后，Z3區(qū)域的圖像。(c) 紙基裝置在不同CIM-EC濃度下的平均光密度值。插圖：Z3區(qū)域在不同CIM-EC濃度下的圖像。

最后，我們驗證了這種集成的紙基設備在尿液樣本中檢測大腸桿菌的實際應用。我們分析了從醫(yī)院患者中收集的40份尿液樣本，這些樣本包括細菌陰性（培養(yǎng)-）、大腸桿菌陰性但細菌陽性（培養(yǎng)+/EC-）和大腸桿菌陽性并帶有黃色菌落（培養(yǎng)+/EC+）。整個操作流程包括：（1）細胞收集（10 min）；（2）細胞裂解（10 min）；（3）紙基檢測（35 min）（圖5a）。如圖5b所示，19份培養(yǎng)陰性樣本和6份培養(yǎng)+/EC-樣本未顯示明顯的顏色變化，而15份培養(yǎng)+/EC+樣本產生了明顯的藍色反應。通過標準曲線，可以實現陽性臨床樣本的半定量檢測，標準曲線由平均光密度與大腸桿菌細胞數之間的關系得出（圖5c）。與尿液培養(yǎng)的金標準相比，我們實現了100%的臨床靈敏度和100%的特異性（圖5d）。

圖5 (a) 紙基裝置檢測臨床尿液樣本中大腸桿菌的操作步驟。(b) 臨床尿液樣本中大腸桿菌定量熱圖。(c) 反應30 min后紙基裝置對尿液樣本制備的 CIM 的顏色反應。(d) 金標準培養(yǎng)方法和紙基檢測法的選擇性和靈敏度比較。

綜上所述，該研究報告了一種利用MaRCD-EC1進行大腸桿菌檢測的無擴增比色分析。在大腸桿菌存在的情況下，固定的MaRCD-EC1被激活，裂解RNA底物，從而釋放HRP標記的DNA探針。釋放的HRP在pH5.3的條件下催化TMB的氧化，允許肉眼讀取結果而無需復雜設備。這種HRP鏈接的DNA酶無擴增策略在酸性條件下從未被報道。MaRCD-EC1和HRP在酸性條件下表現出最高的催化活性，使得該檢測方法在30 min內實現快速和高靈敏度（10² CFU/mL）的檢測?；诖碎_發(fā)了一種用于POCT應用的紙基裝置，其中HRP@MaRCD-EC1作為識別元件，TMB作為顯色底物集成在一起。對40份患者尿液樣本的臨床評估表明，該紙基裝置的臨床靈敏度為100%，特異性為100%。此外，該裝置在室溫下儲存至少30 d，保持穩(wěn)定。綜上所述，該裝置憑借高靈敏度、便攜性、操作簡便以及快速的檢測時間，具有在偏遠和資源匱乏地區(qū)診斷應用的潛力。

論文來源：https://doi.org/10.1039/d4cc01150c

來源：微生物安全與健康網，作者~段子璇。