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無擴(kuò)增快速檢測(cè):紙基酸性脫氧核酶裝置高靈敏度識(shí)別大腸桿菌

發(fā)布時(shí)間:2024-10-17    瀏覽次數(shù):540

大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli)是導(dǎo)致75%尿路感染的元兇,包括膀胱炎和急性腎盂腎炎,這是一種常見的細(xì)菌感染性疾病,對(duì)公共健康構(gòu)成威脅。早期準(zhǔn)確檢測(cè)大腸桿菌對(duì)于控制病程和改善患者治療至關(guān)重要。這需要一種具有高靈敏度和特異性的檢測(cè)方法,以應(yīng)對(duì)疾病早期階段靶標(biāo)的低豐度。盡管聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)作為病原體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)滿足這些要求,但其缺點(diǎn)如操作復(fù)雜和儀器昂貴,限制了其在資源匱乏地區(qū)的初步診斷應(yīng)用。

即時(shí)檢測(cè)(point of care testing, POCT)由于其便攜性、一次性、設(shè)置簡(jiǎn)便以及操作簡(jiǎn)單,已成為實(shí)驗(yàn)室外診斷檢測(cè)的重要工具。紙基設(shè)備是POCT的理想候選者,因?yàn)樗鼈兙哂休p便、一次性、兼容性和低成本等特性。迄今為止,各種紙基POCT設(shè)備已經(jīng)廣泛用于檢測(cè)病原菌,如幽門螺桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、嗜酸乳桿菌等。其中,最流行的紙基設(shè)備是比色檢測(cè),這種方法可以實(shí)現(xiàn)快速且可視化的POCT。然而,這些設(shè)備通常面臨靈敏度不足的問題。引入信號(hào)放大策略是提高靈敏度的常用方法,然而,這增加了成本并延長(zhǎng)了分析時(shí)間。因此,開發(fā)一種無需擴(kuò)增的、能夠快速且高度靈敏地檢測(cè)大腸桿菌的紙基POCT設(shè)備是非常必要的。

裂解RNA的DNA酶(RNA-cleaving DNAzymem, RCD)是一種經(jīng)典的DNA催化劑,能夠進(jìn)行目標(biāo)響應(yīng)的RNA底物裂解。大多數(shù)通過體外選擇獲得的細(xì)菌特異性RCD需要二價(jià)金屬離子的輔助,在中性pH條件下裂解RNA/DNA嵌合底物。這可能導(dǎo)致外源核酸酶的非特異性降解,從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果

近日,大連理工大學(xué)環(huán)境學(xué)院Meng Liu團(tuán)隊(duì)在Chem Comm期刊上發(fā)表了題為:Amplification-free detection of Escherichia coli using an acidic deoxyribozyme-based paper device論文。


為了解決該問題,開發(fā)了一種由大腸桿菌激活的酸性RCD(acidic RCD, aRCD-EC1),該酶只需要一價(jià)金屬離子作為輔因子,并且在pH值為5.3的條件下表現(xiàn)出更高的催化活性。aRCD-EC1能夠在10 min內(nèi)檢測(cè)到低至104 CFU/mL的大腸桿菌。先前研究表明,辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)通常用于比色反應(yīng),并且在酸性條件下表現(xiàn)出最佳的催化性能?;谏鲜鼋Y(jié)果,開發(fā)一種與HRP連接的aRCD-EC1檢測(cè)方法,可能實(shí)現(xiàn)無擴(kuò)增條件下的大腸桿菌的高靈敏度檢測(cè)。

工作原理如圖1所示。aRCD-EC1在5'端被修飾有DNA延伸序列,用于與HRP標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行雜交,并在3'端與生物素修飾,以通過鏈霉親和素–生物素相互作用固定在瓊脂糖珠子上。在大腸桿菌存在的情況下,MaRCD-EC1可以被激活,催化形成的HRP@MaRCD-EC1/珠子的裂解。隨后,釋放的包含HRP的DNA探針可以分離出來,用于在酸性條件下進(jìn)行H?O?介導(dǎo)的3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine, TMB)的氧化反應(yīng),生成藍(lán)色產(chǎn)物。因此,大腸桿菌的檢測(cè)可以通過檢測(cè)HRP的釋放來實(shí)現(xiàn)。


圖1 用于大腸桿菌視覺檢測(cè)的HRP@MaRCD-EC1/beads示意圖。

我們首先采用dPAGE分析在pH5.3條件下測(cè)試了MaRCD-EC1的裂解活性(圖2a)。在大腸桿菌粗細(xì)胞內(nèi)混合物(crude intracellular mixture derived from E. coli, CIM-EC)存在的情況下,MaRCD-EC1表現(xiàn)出表觀速率常數(shù)(kobs)為0.11 min?1,低于aRCD-EC1的kobs(1.18 min?1),30 min后在25°C下的裂解產(chǎn)率為89.2%(圖2b)。隨后,我們測(cè)試了MaRCD-EC1對(duì)非特異性病原體的CIM反應(yīng),包括肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)、銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、角膜炎假單胞菌(B. gladioli)、蠟狀芽孢桿菌(B. cereus)和枯草芽孢桿菌(B. subtilis)。未觀察到裂解產(chǎn)物,表明MaRCD-EC1具有高度特異性(圖2c)。通過加入不同濃度的CIM-EC研究其靈敏度。結(jié)果顯示,MaRCD-EC1可以在30 min內(nèi)檢測(cè)到低至102 CFU/mL的E. coli,展示了其高靈敏度。顯然,RCD-EC1 3'端的生物素修飾僅延長(zhǎng)了分析時(shí)間,對(duì)MaRCD-EC1的選擇性和靈敏度幾乎沒有影響。綜上所述,這些結(jié)果為開發(fā)用于大腸桿菌檢測(cè)的高靈敏度比色探針奠定了基礎(chǔ)。


圖2 (a) MaRCDs的工作原理是通過與CIM-EC中的目標(biāo)結(jié)合激活,不依賴M2?離子。F表示熒光素標(biāo)記的dT,R表示腺苷核糖核苷酸。(b) MaRCD-EC1S在25°C下對(duì)CIM-EC的動(dòng)力學(xué)響應(yīng),圖中給出了kobs值。(c) MaRCD-EC1對(duì)來自不同細(xì)菌的CIM的響應(yīng),包括克雷伯氏肺炎菌(KP)、金黃色葡萄球菌(SA)、銅綠假單胞菌(PA)、角膜炎假單胞菌(BG)、蠟樣芽孢桿菌(BC)、枯草芽孢桿菌(BS)和大腸桿菌(EC)。M =marker,Unclv =未裂解,Clv =已裂解,NC =陰性對(duì)照,%Clv = 裂解百分比,計(jì)算公式為:%Clv = (clv × 100) / (clv + unclv),其中clv為已裂解條帶的體積,unclv為未裂解條帶的體積。(d) 在25°C下反應(yīng)30 min后,10% dPAGE分析MaRCD-EC1對(duì)從10–10? CFU/mL大腸桿菌細(xì)胞制備的CIM-EC的響應(yīng)。

我們接著研究了HRP在不同pH值下的催化活性。如圖3a所示,HRP在弱酸性環(huán)境(pH 5-6)中表現(xiàn)出最高的活性,這與MaRCD-EC1裂解緩沖液相容。通過簡(jiǎn)單的離心將釋放的HRP從瓊脂糖珠中分離出來,并向上清液中加入TMB和H?O?混合物進(jìn)行比色測(cè)定。根據(jù)比色反應(yīng)的kobs與HRP濃度之間的線性關(guān)系,可以計(jì)算出不同反應(yīng)時(shí)間下釋放的HRP比例。在CIM-EC存在的情況下,隨著MaRCD-EC1裂解反應(yīng)時(shí)間的增加,釋放的HRP量逐漸增加,并在30 min內(nèi)達(dá)到平臺(tái)期(圖3b)。相反,在沒有CIM-EC的情況下,沒有觀察到HRP的釋放。

研究人員還研究了基于HRP@MaRCD-EC1/珠子的生物傳感器的傳感性能。如圖3c、e所示,當(dāng)測(cè)試來自克雷伯氏肺炎菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、角膜炎假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的CIM時(shí),未觀察到明顯的比色信號(hào)。通過使用不同濃度的大腸桿菌(10–107 CFU/mL)制備的CIM對(duì)比色法的靈敏度進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果表明,該方法可以檢測(cè)到低至102 CFU/mL的大腸桿菌(圖3d)。比色信號(hào)強(qiáng)度與大腸桿菌濃度相關(guān),使其能夠?qū)崿F(xiàn)半定量的比色檢測(cè)。綜上所述,這些結(jié)果表明,將HRP@MaRCD-EC1固定在瓊脂糖珠上對(duì)傳感性能幾乎沒有影響。


圖3 (a) 不同pH值下HRP的催化活性。(b) 在沒有和存在CIM-EC的情況下珠子中HRP的動(dòng)力學(xué)釋放。(c) 在不同細(xì)菌存在下的相對(duì)顏色強(qiáng)度分析。相對(duì)顏色強(qiáng)度表示為 I/I0,其中I是t = 6 min時(shí)的顏色強(qiáng)度,I0是存在CIM-EC時(shí)的顏色強(qiáng)度。(d) 在不同濃度的CIM-EC存在和不存在的情況下HRP的釋放動(dòng)力學(xué)。S/B = 信號(hào)與背景比。(e) 在不同細(xì)菌CIM存在下HRP@MaRCD-EC1-珠子溶液的上清液圖像。(f) 在不同濃度的CIM-EC下HRP@MaRCD-EC1-珠子溶液的上清液圖像。

在將瓊脂糖珠通過pullulan固定在紙張表面后,我們開發(fā)了一種基于HRP@MaRCD-EC1的紙基傳感器,用于大腸桿菌的比色檢測(cè)。該紙基傳感器具有三個(gè)區(qū)域(圖4a):左側(cè)的傳感區(qū)(Z1)包含用于靶標(biāo)識(shí)別的HRP@MaRCD-EC1,中間區(qū)域(Z2)覆蓋有5%(w/v)的pullulan薄膜,用于控制液體的流速,右側(cè)檢測(cè)區(qū)(Z3)含有用于信號(hào)輸出的TMB。這三個(gè)區(qū)域通過蠟屏障印制在背襯為塑料的Whatman濾紙(1號(hào))上。操作步驟如下:在典型測(cè)試中,將50 μL的CIM-EC加入Z1進(jìn)行靶標(biāo)識(shí)別,并裂解RNA底物以釋放HRP。經(jīng)過30 min的反應(yīng),Z2處的pullulan薄膜會(huì)溶解,允許溶液流向Z3。由于瓊脂糖珠的平均直徑為100 μm,明顯大于Whatman濾紙的平均孔徑(11 μm),因此瓊脂糖珠無法通過毛細(xì)力驅(qū)動(dòng)流動(dòng),只有釋放的HRP可以流向Z3,在H?O?的存在下氧化TMB,從而產(chǎn)生比色信號(hào)。

我們首先通過該紙基設(shè)備對(duì)大腸桿菌進(jìn)行了可視化檢測(cè),并驗(yàn)證了其可行性。在HRP、MaRCD-EC1和CIM-EC的存在下,生成了顏色信號(hào)。結(jié)果表明,裝置上的HRP@MaRCD-EC1/珠子能夠特異性識(shí)別大腸桿菌并釋放HRP以進(jìn)行比色反應(yīng)。隨后,利用不同來源的CIM評(píng)估了裝置的特異性,未觀察到顏色信號(hào)(圖4b),表明其特異性較高。此外,我們發(fā)現(xiàn)顏色強(qiáng)度與大腸桿菌的濃度呈正相關(guān),范圍從102到107 CFU/mL(圖4c)。在30 min內(nèi),該設(shè)備實(shí)現(xiàn)了102 CFU/mL的檢測(cè)限。值得注意的是,與未采用擴(kuò)增過程的報(bào)道紙基設(shè)備相比,該設(shè)備提供了更高的靈敏度(檢測(cè)限為102 CFU/mL)和更短的樣品處理時(shí)間(30 min)。


圖4 (a) 紙基裝置的設(shè)計(jì)及其工作原理。Z1為感應(yīng)區(qū),Z2為閥門區(qū),Z3為檢測(cè)區(qū)。(b) 紙基裝置對(duì)不同細(xì)菌反應(yīng)的平均光密度值。插圖:在添加圖中指示的細(xì)菌后,Z3區(qū)域的圖像。(c) 紙基裝置在不同CIM-EC濃度下的平均光密度值。插圖:Z3區(qū)域在不同CIM-EC濃度下的圖像。

最后,我們驗(yàn)證了這種集成的紙基設(shè)備在尿液樣本中檢測(cè)大腸桿菌的實(shí)際應(yīng)用。我們分析了從醫(yī)院患者中收集的40份尿液樣本,這些樣本包括細(xì)菌陰性(培養(yǎng)-)、大腸桿菌陰性但細(xì)菌陽性(培養(yǎng)+/EC-)和大腸桿菌陽性并帶有黃色菌落(培養(yǎng)+/EC+)。整個(gè)操作流程包括:(1)細(xì)胞收集(10 min);(2)細(xì)胞裂解(10 min);(3)紙基檢測(cè)(35 min)(圖5a)。如圖5b所示,19份培養(yǎng)陰性樣本和6份培養(yǎng)+/EC-樣本未顯示明顯的顏色變化,而15份培養(yǎng)+/EC+樣本產(chǎn)生了明顯的藍(lán)色反應(yīng)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以實(shí)現(xiàn)陽性臨床樣本的半定量檢測(cè),標(biāo)準(zhǔn)曲線由平均光密度與大腸桿菌細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系得出(圖5c)。與尿液培養(yǎng)的金標(biāo)準(zhǔn)相比,我們實(shí)現(xiàn)了100%的臨床靈敏度和100%的特異性(圖5d)。


圖5 (a) 紙基裝置檢測(cè)臨床尿液樣本中大腸桿菌的操作步驟。(b) 臨床尿液樣本中大腸桿菌定量熱圖。(c) 反應(yīng)30 min后紙基裝置對(duì)尿液樣本制備的 CIM 的顏色反應(yīng)。(d) 金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法和紙基檢測(cè)法的選擇性和靈敏度比較。

綜上所述,該研究報(bào)告了一種利用MaRCD-EC1進(jìn)行大腸桿菌檢測(cè)的無擴(kuò)增比色分析。在大腸桿菌存在的情況下,固定的MaRCD-EC1被激活,裂解RNA底物,從而釋放HRP標(biāo)記的DNA探針。釋放的HRP在pH5.3的條件下催化TMB的氧化,允許肉眼讀取結(jié)果而無需復(fù)雜設(shè)備。這種HRP鏈接的DNA酶無擴(kuò)增策略在酸性條件下從未被報(bào)道。MaRCD-EC1和HRP在酸性條件下表現(xiàn)出最高的催化活性,使得該檢測(cè)方法在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速和高靈敏度(102 CFU/mL)的檢測(cè)。基于此開發(fā)了一種用于POCT應(yīng)用的紙基裝置,其中HRP@MaRCD-EC1作為識(shí)別元件,TMB作為顯色底物集成在一起。對(duì)40份患者尿液樣本的臨床評(píng)估表明,該紙基裝置的臨床靈敏度為100%,特異性為100%。此外,該裝置在室溫下儲(chǔ)存至少30 d,保持穩(wěn)定。綜上所述,該裝置憑借高靈敏度、便攜性、操作簡(jiǎn)便以及快速的檢測(cè)時(shí)間,具有在偏遠(yuǎn)和資源匱乏地區(qū)診斷應(yīng)用的潛力。

論文來源:https://doi.org/10.1039/d4cc01150c

來源:微生物安全與健康網(wǎng),作者~段子璇。

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