中國(guó)工程院食品安全院士團(tuán)隊(duì)

科研成果轉(zhuǎn)化平臺(tái)

淋球菌耐藥性是被WHO和CDC認(rèn)定的高危級(jí)抗菌素耐藥性（AMR）威脅。從2006年至今，淋球菌耐藥性迫使臨床治療方案逐漸失效，從最初的5種治療方案縮減到僅限頭孢曲松和阿奇霉素，而淋球菌對(duì)頭孢曲松和阿奇霉素的耐藥性也在出現(xiàn)。這樣的威脅強(qiáng)調(diào)了對(duì)淋球菌耐藥性及時(shí)和準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)的必要性。相較于耗時(shí)費(fèi)力的金標(biāo)準(zhǔn)AST技術(shù)，NAAT技術(shù)能夠高特異且快速地檢測(cè)耐藥淋球菌，其應(yīng)用也在不斷更新發(fā)展，但因其根本上不具備提供耐藥表型的能力，反而限制了臨床實(shí)驗(yàn)室淋球菌培養(yǎng)和表型AST技術(shù)的發(fā)展，進(jìn)一步加劇了挑戰(zhàn)。為促進(jìn)針對(duì)淋球菌的快速有效的AMR監(jiān)測(cè)，并適應(yīng)當(dāng)前臨床診斷轉(zhuǎn)向NAAT的應(yīng)用大趨勢(shì)，基于基因?qū)用娴谋硇头治黾夹g(shù)成為了當(dāng)前的一大研究熱點(diǎn)?；诖?，Tza-Huei Wang團(tuán)隊(duì)提出了一種直接qPCR方法，應(yīng)用于淋球菌的病原鑒定和藥敏分析。該研究的創(chuàng)新點(diǎn)可歸結(jié)為2點(diǎn)：（1）規(guī)避了核酸技術(shù)中常見(jiàn)的額外的DNA提取步驟，簡(jiǎn)化了操作流程；（2）引入了一種無(wú)蛋白培養(yǎng)基：GW，能夠支持低接種量的淋球菌的生長(zhǎng)。

簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)，直接qPCR的工作原理可以概括為：淋球菌在不同生長(zhǎng)環(huán)境（抗生素存在與否；抗生素暴露的劑量）的存活狀態(tài)表現(xiàn)不一，而這種差異可以通過(guò)qPCR的Cq值體現(xiàn)出來(lái)，由此完成病原鑒定和藥敏測(cè)試（圖1）。qPCR靶向淋球菌的opa基因，通過(guò)引入高抗抑制劑聚合酶，避免了額外的核酸提取和純化步驟，可直接在添加有抗生素的GW培養(yǎng)基（10 μL）中進(jìn)行qPCR擴(kuò)增?；趒PCR的藥敏分析是通過(guò)比較細(xì)菌的生長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)的，因而，作者首先評(píng)價(jià)了直接qPCR測(cè)定淋球菌在GW培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。在這里，Cq是一個(gè)以2為基的對(duì)數(shù)量，細(xì)菌密度每增加一倍，Cq值會(huì)對(duì)應(yīng)下降。因而，基線Cq減去測(cè)試組Cq獲得的負(fù)值（?ΔCq）可以用來(lái)量化在對(duì)數(shù)尺度上的細(xì)菌密度的倍數(shù)變化。使用這種表示法，可以通過(guò)?ΔCq—培養(yǎng)時(shí)間圖的斜率來(lái)計(jì)算倍增時(shí)間。在本研究中使用的淋球菌菌株中，?ΔCq隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化近似呈線性增長(zhǎng)，倍增時(shí)間約為1小時(shí)，表明淋球菌在GW培養(yǎng)基中呈指數(shù)生長(zhǎng)。然后，作者向GW培養(yǎng)基中加入環(huán)丙沙星（0.06 μg/mL或0）對(duì)淋球菌進(jìn)行孵育，以此初步判斷方法的可行性。結(jié)果顯示，基于直接qPCR的藥敏分析僅需抗生素孵育1 h即可實(shí)現(xiàn)。相較之下，基于OD值的宏觀藥敏分析則需至少9 h的抗生素-細(xì)菌共孵育時(shí)間（圖2）。另外，從圖中也可看到，直接qPCR方法具有更高的動(dòng)態(tài)范圍和更小的偏差。隨后，作者進(jìn)一步引入3種常用的抗生素：青霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星，并在共孵育4 h后評(píng)估淋球菌的生長(zhǎng)情況。在此，作者引入了一個(gè)劑量-反應(yīng)生長(zhǎng)模型，內(nèi)含2個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，一個(gè)是2^?ΔCq（細(xì)菌定量），一個(gè)是細(xì)菌活力（0-100），以此來(lái)展現(xiàn)抗菌藥物濃度和細(xì)胞活力之間的關(guān)系。該模型能夠估計(jì)細(xì)胞活力為最大值的80%（EC₈₀）時(shí)的抗生素濃度，以此預(yù)測(cè)給定抗菌藥物的耐藥性水平，以這種方式導(dǎo)出的EC₈₀值與CLSI質(zhì)量控制范圍完全一致（圖3）。進(jìn)一步，作者利用2株標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 49226和ATCC 43069）和5株臨床分離株及3種抗生素：青霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星評(píng)價(jià)了方法的藥敏分析能力。同樣的，EC₈₀值仍然作為藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)，基于此獲得的耐藥/中介/敏感信息與傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)方法（MIC值）獲得的結(jié)果基本一致，基本一致率為85.7%，分類一致率為94.5%，由此顯示了本方法為淋球菌耐藥性提供準(zhǔn)確和客觀的臨床解釋的潛力（圖4）。

總的來(lái)說(shuō)，本研究發(fā)展的表型-基因型AST技術(shù)突破了傳統(tǒng)藥敏技術(shù)的耗時(shí)長(zhǎng)以及NAAT技術(shù)的結(jié)果代表性欠缺的兩大弊端，在淋球菌感染的鑒定及藥敏分析上具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。不過(guò)，研究始終圍繞在3種抗菌素，且臨床樣本量不足，研究結(jié)果代表性仍然欠缺，尚需大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖1 淋球菌鑒定和AST的直接qPCR檢測(cè)流程。將淋球菌接種于GW培養(yǎng)基中，并向其加入不同劑量的抗生素，孵育1-4小時(shí)后，從中取樣進(jìn)行直接qPCR檢測(cè)，以此獲得感染病原信息和藥敏信息。另外，在此可通過(guò)內(nèi)置的熔融曲線分析來(lái)驗(yàn)證擴(kuò)增子的特異性。圖中ΔCq為測(cè)試組與對(duì)照組之間的Cq差值。

圖2 通過(guò)直接qpcr和OD檢測(cè)ATCC 49226的生長(zhǎng)情況。將10⁵個(gè)淋球菌接種于10 mL的GW培養(yǎng)基中，含（黑點(diǎn)）和無(wú)（紅點(diǎn)）0.06 μL/mL環(huán)丙沙星。每小時(shí)取一次樣品（300 μL）進(jìn)行試驗(yàn)。所有測(cè)量的Cq值減去0 h測(cè)定的Cq值以進(jìn)行歸一化。（A）直接qPCR方法具有較寬的定量范圍，可以區(qū)分藥物處理和未處理細(xì)胞在培養(yǎng)1 h后的生長(zhǎng)。（B）基于OD的定量能力相對(duì)較有限，動(dòng)態(tài)范圍較窄。它可以區(qū)分藥物處理細(xì)胞和未處理細(xì)胞在9 h培養(yǎng)后的生長(zhǎng)。

圖3 基于直接qPCR的劑量-反應(yīng)模型。圖中顯示了淋球菌在環(huán)丙沙星、青霉素和四環(huán)素處理下的劑量-反應(yīng)模型，最大生長(zhǎng)活力的80%對(duì)應(yīng)的抗生素濃度為最低抑菌濃度（EC₈₀），與CLSI方法獲得的值基本一致。

圖4 基于直接qPCR的檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)MIC值的比較。

原文DOI: 10.1021/acsinfecdis.8b00104

來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~鄒晶晶