中國工程院食品安全院士團隊

科研成果轉化平臺

淋球菌耐藥性是被WHO和CDC認定的高危級抗菌素耐藥性（AMR）威脅。從2006年至今，淋球菌耐藥性迫使臨床治療方案逐漸失效，從最初的5種治療方案縮減到僅限頭孢曲松和阿奇霉素，而淋球菌對頭孢曲松和阿奇霉素的耐藥性也在出現(xiàn)。這樣的威脅強調了對淋球菌耐藥性及時和準確地監(jiān)測的必要性。相較于耗時費力的金標準AST技術，NAAT技術能夠高特異且快速地檢測耐藥淋球菌，其應用也在不斷更新發(fā)展，但因其根本上不具備提供耐藥表型的能力，反而限制了臨床實驗室淋球菌培養(yǎng)和表型AST技術的發(fā)展，進一步加劇了挑戰(zhàn)。為促進針對淋球菌的快速有效的AMR監(jiān)測，并適應當前臨床診斷轉向NAAT的應用大趨勢，基于基因層面的表型分析技術成為了當前的一大研究熱點?；诖?，Tza-Huei Wang團隊提出了一種直接qPCR方法，應用于淋球菌的病原鑒定和藥敏分析。該研究的創(chuàng)新點可歸結為2點：（1）規(guī)避了核酸技術中常見的額外的DNA提取步驟，簡化了操作流程；（2）引入了一種無蛋白培養(yǎng)基：GW，能夠支持低接種量的淋球菌的生長。

簡單說來，直接qPCR的工作原理可以概括為：淋球菌在不同生長環(huán)境（抗生素存在與否；抗生素暴露的劑量）的存活狀態(tài)表現(xiàn)不一，而這種差異可以通過qPCR的Cq值體現(xiàn)出來，由此完成病原鑒定和藥敏測試（圖1）。qPCR靶向淋球菌的opa基因，通過引入高抗抑制劑聚合酶，避免了額外的核酸提取和純化步驟，可直接在添加有抗生素的GW培養(yǎng)基（10 μL）中進行qPCR擴增?；趒PCR的藥敏分析是通過比較細菌的生長實現(xiàn)的，因而，作者首先評價了直接qPCR測定淋球菌在GW培養(yǎng)基中的生長情況。在這里，Cq是一個以2為基的對數(shù)量，細菌密度每增加一倍，Cq值會對應下降。因而，基線Cq減去測試組Cq獲得的負值（?ΔCq）可以用來量化在對數(shù)尺度上的細菌密度的倍數(shù)變化。使用這種表示法，可以通過?ΔCq—培養(yǎng)時間圖的斜率來計算倍增時間。在本研究中使用的淋球菌菌株中，?ΔCq隨著培養(yǎng)時間的變化近似呈線性增長，倍增時間約為1小時，表明淋球菌在GW培養(yǎng)基中呈指數(shù)生長。然后，作者向GW培養(yǎng)基中加入環(huán)丙沙星（0.06 μg/mL或0）對淋球菌進行孵育，以此初步判斷方法的可行性。結果顯示，基于直接qPCR的藥敏分析僅需抗生素孵育1 h即可實現(xiàn)。相較之下，基于OD值的宏觀藥敏分析則需至少9 h的抗生素-細菌共孵育時間（圖2）。另外，從圖中也可看到，直接qPCR方法具有更高的動態(tài)范圍和更小的偏差。隨后，作者進一步引入3種常用的抗生素：青霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星，并在共孵育4 h后評估淋球菌的生長情況。在此，作者引入了一個劑量-反應生長模型，內含2個關鍵參數(shù)，一個是2^?ΔCq（細菌定量），一個是細菌活力（0-100），以此來展現(xiàn)抗菌藥物濃度和細胞活力之間的關系。該模型能夠估計細胞活力為最大值的80%（EC₈₀）時的抗生素濃度，以此預測給定抗菌藥物的耐藥性水平，以這種方式導出的EC₈₀值與CLSI質量控制范圍完全一致（圖3）。進一步，作者利用2株標準菌株（ATCC 49226和ATCC 43069）和5株臨床分離株及3種抗生素：青霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星評價了方法的藥敏分析能力。同樣的，EC₈₀值仍然作為藥敏判定標準，基于此獲得的耐藥/中介/敏感信息與傳統(tǒng)培養(yǎng)技術方法（MIC值）獲得的結果基本一致，基本一致率為85.7%，分類一致率為94.5%，由此顯示了本方法為淋球菌耐藥性提供準確和客觀的臨床解釋的潛力（圖4）。

總的來說，本研究發(fā)展的表型-基因型AST技術突破了傳統(tǒng)藥敏技術的耗時長以及NAAT技術的結果代表性欠缺的兩大弊端，在淋球菌感染的鑒定及藥敏分析上具有較強的應用潛力。不過，研究始終圍繞在3種抗菌素，且臨床樣本量不足，研究結果代表性仍然欠缺，尚需大量實驗驗證。

圖1 淋球菌鑒定和AST的直接qPCR檢測流程。將淋球菌接種于GW培養(yǎng)基中，并向其加入不同劑量的抗生素，孵育1-4小時后，從中取樣進行直接qPCR檢測，以此獲得感染病原信息和藥敏信息。另外，在此可通過內置的熔融曲線分析來驗證擴增子的特異性。圖中ΔCq為測試組與對照組之間的Cq差值。

圖2 通過直接qpcr和OD檢測ATCC 49226的生長情況。將10⁵個淋球菌接種于10 mL的GW培養(yǎng)基中，含（黑點）和無（紅點）0.06 μL/mL環(huán)丙沙星。每小時取一次樣品（300 μL）進行試驗。所有測量的Cq值減去0 h測定的Cq值以進行歸一化。（A）直接qPCR方法具有較寬的定量范圍，可以區(qū)分藥物處理和未處理細胞在培養(yǎng)1 h后的生長。（B）基于OD的定量能力相對較有限，動態(tài)范圍較窄。它可以區(qū)分藥物處理細胞和未處理細胞在9 h培養(yǎng)后的生長。

圖3 基于直接qPCR的劑量-反應模型。圖中顯示了淋球菌在環(huán)丙沙星、青霉素和四環(huán)素處理下的劑量-反應模型，最大生長活力的80%對應的抗生素濃度為最低抑菌濃度（EC₈₀），與CLSI方法獲得的值基本一致。

圖4 基于直接qPCR的檢測結果與金標準MIC值的比較。

原文DOI: 10.1021/acsinfecdis.8b00104

來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~鄒晶晶