中國工程院食品安全院士團(tuán)隊(duì)

科研成果轉(zhuǎn)化平臺

在環(huán)境質(zhì)量控制、臨床診斷和食品工業(yè)中控制和識別細(xì)菌污染是十分重要的。本文檢測的致病菌為金黃色葡萄球菌，金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽性兼性厭氧菌，可以從乳腺炎奶牛的乳汁中分離到，可引起嚴(yán)重的感染，癥狀包括惡心、嘔吐、腹瀉、全身不適和虛弱，對老年人和年輕人、孕婦和免疫系統(tǒng)受損的人尤其嚴(yán)重，對公眾健康構(gòu)成威脅。在檢測方面，已經(jīng)有多種包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù)方法以及基于免疫的方法，包括ELISA等檢測方法。然而，這些方法耗時(shí)、費(fèi)力和(或)昂貴，因此，許多研究人員正在尋找快速、敏感檢測食品中病原體的新方法。

本文采用了非共價(jià)印跡方法，一般來說，分子印跡利用分子模板在交聯(lián)聚合物中創(chuàng)建選擇性結(jié)合位點(diǎn)。使用這種方法，可以為目標(biāo)模板/分析物制備選擇性識別材料。分子印跡聚合物(MIPs)與生物大分子(如抗體、酶等)相比具有更高的化學(xué)和物理穩(wěn)定性。此外，MIPs可以大量生產(chǎn)，并且在大多數(shù)情況下可以重復(fù)使用。此外，本文利用多巴胺制作MIP層，因?yàn)槎喟桶吩趬A性條件下能夠進(jìn)行氧化聚合(作為氧化劑)，并在多種支撐材料上生成聚多巴胺層，還可以作為功能單體和交聯(lián)劑，提高了印跡效果，簡化了合成。

文中，MIP層被創(chuàng)建在磁顆粒(MPs)的表面。MPs具有較高的磁靈敏度，因此，與目標(biāo)分子相互作用后，可以很容易地收集并利用外部磁場分離，無需離心或過濾。這意味著磁性顆粒有助于從大量樣品中預(yù)富集細(xì)菌，從而使靈敏的檢測成為可能。

模板清洗優(yōu)化

在印跡材料可以用于應(yīng)用之前，必須去除模板分子。徹底去除會產(chǎn)生敏感和特定的識別部位，但在清洗過程中，可能會發(fā)生一些損壞，如溶劑引起的塌陷或腫脹。因此，有必要找到一種模板移除方法，能夠可靠地移除大部分模板，并且不會明顯損壞制備的MIPs。在本文的研究中，考慮了三種不同的方法，即3%醋酸(HAc)，5% HAc和1% SDS，比例為1:1，最后，裂解溶液。從圖1中可以看出，最合適的方法是1:1 5%的HAc和1%的SDS，這樣可以去除大部分的模板，并且在接下來的步驟中，可以清楚地看到MIPs仍然具有功能。

以前的研究表明，在洗滌液中SDS的存在，特別是與HAc結(jié)合時(shí)，增加了非特異性的結(jié)合。因此，在檢測之前，洗滌液必須完全除去。因此，在本文中，先用5%的HAc和1%的SDS洗滌后，再用MilliQ水洗滌MIPs三次。但是，當(dāng)裂解液被用來移除模板時(shí)，它破壞了聚多巴胺層，使模板變得無法發(fā)揮作用。

圖 1模板拆除過程的優(yōu)化

優(yōu)化非結(jié)合和非特定結(jié)合分析物的洗滌

另一個(gè)重要的步驟是去除非結(jié)合和非特異性結(jié)合的分析物。特定的相互作用意味著細(xì)菌會重新結(jié)合到明確的空腔中。這些相互作用應(yīng)該比任何非特異性的相互作用更強(qiáng)，而非特異性的相互作用很容易被合適的溶劑所打斷。溶劑必須除去非特異性結(jié)合的分析物以及其他干擾物，但同時(shí)不應(yīng)破壞所需的特異性相互作用。對于非結(jié)合和非特異性結(jié)合的分析物的去除，本文嘗試了三種不同的方法，即采用MilliQ水、3%的HAc和5%的HAc和1%的SDS，比例為1:1。得到的數(shù)據(jù)如圖2所示?？梢钥吹組illiQ水是最合適的(圖2A-B)。從NIP的測量值中得到的值表明，MilliQ水可以從MIPs中除去非特異性相互作用。然而，在3% HAc或5% HAc與1% SDS混合的情況下，則無法進(jìn)行特異性結(jié)合。

圖 2 優(yōu)化未結(jié)合分析物的去除

MIP的結(jié)合能力和吸附動力學(xué)

為了評價(jià)MIPs的結(jié)合特性，比較了不同初始濃度(1 × 106 ~ 1 × 102 CFU·ml?1)的細(xì)菌，以確定MIPs對NIPs的結(jié)合能力。如圖3A所示，細(xì)菌在MIPs上的吸附隨著細(xì)菌濃度的增加而增加。在使用的條件下，即使在細(xì)菌濃度最高的情況下，表面也沒有達(dá)到飽和，因此可以發(fā)現(xiàn)本文制備的聚合物表面的結(jié)合能力足夠高，可以達(dá)到預(yù)期的目的。

NIPs是在與MIPs相同的條件下制備的，但是不存在模板細(xì)菌，并作為非特異性結(jié)合的指標(biāo)：NIPs表面隨機(jī)排列的功能基團(tuán)與分析物相互作用，導(dǎo)致非特異性結(jié)合。

圖3B為細(xì)菌在MIPs和NIPs表面的吸附動力學(xué)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)在1 × 106 CFU·ml?1條件下進(jìn)行。隨后，將MIPs與NIPs的結(jié)合能力進(jìn)行比較。MIPs表面的熒光強(qiáng)度在前10 min迅速增加，20 min后達(dá)到吸附平衡，不再增加。NIPs的熒光強(qiáng)度增加緩慢，6 min后達(dá)到平衡。通過對比我們可以看出，MIPs和NIPs的結(jié)合能力有較大的差異，且MIPs的結(jié)合能力更強(qiáng)。

圖 3 MIPs和NIPs對細(xì)菌的吸附動力學(xué)(A)和等溫線(B)

分子印跡聚合物的選擇性研究以及牛奶樣品中細(xì)菌的提取

為了證明選擇性，有必要測量MIPs和可能競爭的分析物之間的相互作用。在本文中，選擇糞腸球菌作為競爭細(xì)菌，因?yàn)樵摷?xì)菌是革蘭氏陽性細(xì)菌，且大小和形狀與金黃色葡萄球菌相似(0.5-2μm)。為了證明MIPs對金黃色葡萄球菌的選擇性，我們進(jìn)行了一項(xiàng)結(jié)合研究，結(jié)果如圖4A所示。為金黃色葡萄球菌制備的MIPs具有選擇性，僅有少量糞腸球菌與MIPs和NIPs表面結(jié)合，且無特異性。

通過在已知濃度(1 × 106 CFU·ml?1)的患有乳腺炎的奶牛的牛奶中選擇性分離金黃色葡萄球菌，研究了該方法的保真度，并與從緩沖液中分離得到的值進(jìn)行了比較。如圖4B所示，在牛奶樣品中檢測金黃色葡萄球菌的效率與在緩沖懸液中相同。

圖 4 A)MIP選擇性圖。金黃色葡萄球菌(SA)被用作MIP制備的模板，糞腸球菌(EF)被用作競爭對手。B)不同基質(zhì)(牛奶和緩沖液)SA分離效率的比較。

磁性分子印跡聚合物

本文的方法進(jìn)一步驗(yàn)證了來自當(dāng)?shù)爻械臉颖?，來自一頭乳腺炎奶牛的生奶，以及來自健康奶牛的牛奶。得到的結(jié)果如圖5A-H所示。驗(yàn)證了該方法的適用性，并在模型和加標(biāo)的真實(shí)樣品中檢測到金黃色葡萄球菌。在該方法的檢測限(1 × 103 CFU·ml?1)下，超市樣品或健康奶牛的牛奶中含有金黃色葡萄球菌。

圖 5 磁性顆粒表面聚多巴胺MIP熒光顯微鏡檢測金黃色葡萄球菌

此外，使用添加金黃色葡萄球菌的煮熟大米對非液體食品樣品進(jìn)行分析(圖5I和J)。根據(jù)得到的數(shù)據(jù)，可以對所有樣品進(jìn)行定量分析，如圖6所示。根據(jù)校準(zhǔn)圖，最多可確定5700 CFU·ml?1，這與之前的研究一致，并通過瓊脂上的細(xì)菌培養(yǎng)得到驗(yàn)證(如圖6A-E的插圖所示)。結(jié)果表明，該方法可檢測出1 × 103 CFU·ml?1的金黃色葡萄球菌。

圖 6 實(shí)際樣品分析的熒光定量

結(jié)論：以多巴胺為功能單體，通過非共價(jià)分子印跡技術(shù)開發(fā)了金黃色葡萄球菌選擇性MIPs，并對其識別能力進(jìn)行了評價(jià)。得到的印跡聚合物在最佳吸附條件下具有快速的吸附動力學(xué)、良好的吸附性能和較高的選擇性。采用這種新方法，牛奶中細(xì)菌的檢測濃度為1 × 103 CFU·ml?1，符合歐盟食品微生物控制法規(guī)規(guī)定的限度。該方法簡單、快速、環(huán)保、專屬性強(qiáng)，且與其他方法相比，生產(chǎn)成本低。因此，該方法的實(shí)施有助于降低細(xì)菌檢測的成本，并可能適用于醫(yī)藥或食品行業(yè)。

參考文獻(xiàn)：Bezdekova J, Zemankova K, Hutarova J, Kociova S, Smerkova K, Adam V, Vaculovicova M. Magnetic molecularly imprinted polymers used for selective isolation and detection of Staphylococcus aureus. Food Chem. 2020 Aug 15;321:126673. doi: 10.1016/j.foodchem.2020.126673. Epub 2020 Mar 23. PMID: 32278983.

來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~翟慧潺
鏈接：https://www.mbiosh.com/column/testing-technology/testing-technology-method/779