艱難梭菌是一種常見的醫(yī)院內(nèi)感染病原體，它能引發(fā)腹瀉，嚴(yán)重時可導(dǎo)致危及生命的結(jié)腸炎。目前，艱難梭菌感染的診斷主要依賴于核酸擴(kuò)增檢測（NAAT）和免疫分析（IA）等方法。這些方法主要檢測病原體的存在或毒素 A、B 的濃度，但由于不同菌株產(chǎn)生的毒素 A 和 B 活性差異較大，毒素濃度并不能準(zhǔn)確反映疾病的嚴(yán)重程度。而且，其他細(xì)菌也可能因水平基因轉(zhuǎn)移產(chǎn)生類似活性的毒素，這進(jìn)一步增加了診斷的復(fù)雜性。
新的 MALDI-TOF-MS 檢測方法以天然 RhoA 蛋白為底物，間接測定人類糞便中毒素 B 的酶活性。研究人員先制備了帶有生物素標(biāo)簽的重組 RhoA 蛋白底物，利用其與 NeutrAvidin MALDI 芯片的特異性結(jié)合，將 RhoA 底物固定在芯片上。當(dāng)糞便樣本中的毒素 B 與芯片上的 RhoA 底物接觸時，會使 RhoA 發(fā)生酶促糖基化反應(yīng)。隨后，通過 MALDI-TOF-MS 直接檢測芯片上的反應(yīng)產(chǎn)物，根據(jù) RhoA 蛋白糖基化水平的變化，就能間接判斷毒素 B 的活性。
圖 1：RhoA 凝膠過濾純化結(jié)果，確定目標(biāo)蛋白所在餾分。
圖 2：優(yōu)化后的 MALDI - TOF - MS 檢測毒素 B 活性的工作流程。
研究過程中，研究人員對 RhoA 底物進(jìn)行了純化和質(zhì)譜分析，確保其質(zhì)量和純度符合實(shí)驗要求。在優(yōu)化檢測條件時，對多種 MALDI 基質(zhì)進(jìn)行了測試，最終確定 α- 氰基 - 4 - 羥基肉桂酸（HCCA）基質(zhì)效果最佳。同時，通過調(diào)整反應(yīng)緩沖液的成分、添加蛋白酶抑制劑等方式，提高了檢測的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，并確定 30-80 分鐘為最佳反應(yīng)時間。在檢測限實(shí)驗中，當(dāng)毒素 B 濃度為 32 ng/mL 時，糖基化 RhoA 離子的平均信噪比達(dá)到 17，表明該方法具有較高的靈敏度。
圖 3：芯片上完整與糖基化 RhoA 的 MALDI - MS 光譜，體現(xiàn)毒素 B 作用。
圖 4：不同濃度毒素 B 處理后雙電荷 RhoA 蛋白質(zhì)譜圖，32ng/mL 可現(xiàn)糖基化峰。
研究人員用優(yōu)化后的檢測方法對 20 例疑似艱難梭菌感染患者的糞便樣本進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，在 4 個樣本中檢測到了毒素 B 的活性，其中部分結(jié)果與醫(yī)院現(xiàn)有的檢測方法一致，但也存在一些差異。例如，有兩個樣本在醫(yī)院的 IA 檢測中呈陽性，而新方法檢測為陰性；另外兩個樣本則相反。這種差異可能是由于不同檢測方法針對的是毒素的不同特性（活性與濃度），以及樣本中毒素 B 的活性狀態(tài)不同所致。
圖 5：0.8μg/mL 毒素 B 下芯片變異測試箱線圖，展示數(shù)據(jù)離散度。
圖 6：毒素 B 陽性患者樣本中 RhoA 底物質(zhì)譜圖，示樣本可能含活性毒素。
該檢測方法具有顯著優(yōu)勢。它無需對病原體進(jìn)行培養(yǎng)，大大縮短了檢測時間，提高了檢測效率，還能提供毒素 B 的活性信息，有助于更準(zhǔn)確地評估感染的嚴(yán)重程度。此外，該方法還可以識別其他通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得艱難梭菌毒素產(chǎn)生基因的細(xì)菌。不過，該方法也存在一定的局限性，人類糞便樣本的復(fù)雜基質(zhì)會影響 RhoA 蛋白的穩(wěn)定性，進(jìn)而對檢測靈敏度產(chǎn)生不利影響。
這項研究為艱難梭菌感染的診斷提供了一種新的思路和方法，盡管目前只是概念驗證階段，但未來經(jīng)過進(jìn)一步優(yōu)化和大規(guī)模評估后，有望成為臨床診斷的重要補(bǔ)充手段，為患者的精準(zhǔn)治療提供有力支持。
參考文獻(xiàn)：Dvorak J, Fojtík L, Adámková L, et al. Proof-of-concept MALDI-TOF-MS assay for the detection of Toxin B enzymatic activity in Clostridioides difficile infection[J]. Microbiology Spectrum, 2025: e02453-24.
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~徐禮龍。
