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從壞死蠵海龜?shù)爸蟹蛛x鑒定細(xì)菌的生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法比較

發(fā)布時(shí)間:2014-01-13      瀏覽次數(shù):6259    分享:

摘要

目的:比較生化與分子生物學(xué)兩種方法對(duì)壞的蠵龜?shù)拔⑸锓N群的鑒定。

方法與結(jié)果:對(duì)兩種生化方法(API和Microgen)與一種分子生物學(xué)方法(16S rRNA序列分析)在成本、鑒定、其它方法的數(shù)據(jù)確證、便于使用、資源和軟件等方面進(jìn)行比較。

結(jié)果,分子生物學(xué)方法是昂貴的,并且經(jīng)過測試相對(duì)于采用API方法的74%只有66%的分離率被識(shí)別。一個(gè)74%的鑒定差異發(fā)生在API與16S rRNA分析之間。而兩個(gè)生化鑒定方法成本可相媲美,但Microgen更容易使用,并且與API 20E和API 20NE聯(lián)合使用結(jié)果相比較,所產(chǎn)生的鑒定差異是最小的(29%)。

結(jié)論:Microgen識(shí)別系統(tǒng)似乎比API或16S rRNA序列分析更適合用于鑒定蠵海龜?shù)爸械奈⑸锓N群。

研究的意義和影響:

大多數(shù)的鑒定方法并不用于微生物的環(huán)境分離。而鑒定系統(tǒng)的相互比較將為生態(tài)學(xué)研究中環(huán)境細(xì)菌的鑒別提供更好的選擇方法。

簡介:
蠵海龜是最常見的海龜種,筑巢于格魯吉亞且部分嗜溫的種群分布于美國(Bo-wen and Karl 1997)。雖然全球范圍內(nèi)蠵海龜?shù)钠骄趸晒β蚀笥?0%(Miller 1997),但于2006年蠵海龜在全格魯吉亞的孵化成功概率只有63%。而在吉柯島,一個(gè)格魯吉亞的最南端的屏障島嶼,在2006年的產(chǎn)卵季節(jié),孵化成功率只有52.5%(Dodd and Mackinnon 2006)。

在2004年,我們發(fā)起了一個(gè)長期的研究,探討蠵海龜?shù)暗淖冑|(zhì)和蛋胚胎死亡過程中微生物污染的潛在作用。迄今為止很少有研究鑒別出與未孵化的海龜?shù)跋嚓P(guān)的微生物(Wyneken et al.1988;Girondot et al.1990;Mo et al.1990)。

在2004,2005和2006年的8月和9月期間,從巢里收集蠵海龜?shù)啊暮}數(shù)巴獗砻媸占奈⑸锓N群與從胚胎液體中分離的微生物種群相比較。初步結(jié)果表明,微生物污染可能會(huì)在海龜?shù)皦乃乐邪l(fā)揮作用,腸道病原體可能會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡(Cravenet al.2007)。在我們3年的研究中,利用了幾種方法來鑒定分離細(xì)菌。在這份報(bào)告中,我們評(píng)估了三種不同的常用于環(huán)境細(xì)菌鑒定分離方法的表現(xiàn)。

目前用于檢定與識(shí)別細(xì)菌分離株的方法包括各種常規(guī)的表型,生化,酶和分子生物學(xué)檢測(Krieg 1994;Smibert and Krieg 1994;Baron et al.1995;Miller andO’Hara 1995)。利用表型和生化檢驗(yàn)用于細(xì)菌的鑒定是多年的傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)。這些測試系統(tǒng)的數(shù)量近年來得到了增長。目前,有許多商業(yè)化的多重測試系統(tǒng)可供使用。生化系統(tǒng)在傳統(tǒng)上一直用于鑒定如弧菌和腸桿菌科成員的特定臨床病原體。盡管有些研究顯示出與這些鑒定系統(tǒng)相關(guān)的高精確率報(bào)導(dǎo)(Sogaard et al.1986;O’Hara et al.2003;Croci et al.2007),但一些另外的研究卻報(bào)導(dǎo)出了這些系統(tǒng)不太令人滿意的病原體鑒定結(jié)果。(Israil et al.2003;Colodner et al.2004;Martinez-Urtaza et al.2004)。此外,因?yàn)榄h(huán)境細(xì)菌在計(jì)算機(jī)化的數(shù)據(jù)庫信息不足,基于生化反應(yīng)的鑒定系統(tǒng)可能無法可靠地對(duì)環(huán)境細(xì)菌分離鑒定。

近年來,分子生物學(xué)方法已用于微生物的常規(guī)鑒定,或作為豐度,多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究的直接措施(Krieg 1994;Gevers and Coenye 2007;Liu and Stahl 2007)。常見的方法包括核酸序列修復(fù)的使用,基因組DNA雜交,核酸指紋和核酸擴(kuò)增。雖然分子生物學(xué)方法已被證明是非常敏感的,但他們有自己的局限性。核酸擴(kuò)增程序能夠確定特定微生物的DNA或RNA是否在目前的樣品中,但不能確定生物體的生存能力。分子生物學(xué)的方法總是局限于細(xì)菌數(shù)據(jù)庫大小的程度,而且往往需要復(fù)雜的程序,訓(xùn)練有素的人員和昂貴的專用設(shè)備。

在我們的第一個(gè)3年的研究中,針對(duì)環(huán)境分離鑒定的微生物,我們比較和評(píng)估了三個(gè)不同的方法:生物梅里埃(API 20E)和(API 20NE)識(shí)別系統(tǒng)(Biomerieux,Marcy l’Etoile,France;www.industry.biomerieux-usa.com),Microgen的GNA和GNB生化檢測試劑盒(Microbiology International,Surrey,UK;www.microgenbioproducts.com),和Accugenix的16s rRNA 基因的遺傳分析(Accugenix,Newark,DE,USA; www.acugenix.com)。考慮的因素包括識(shí)別的能力,與其他方法的確證,成本,易用性,指示系統(tǒng)和網(wǎng)絡(luò)資源,并提供的數(shù)據(jù)庫/計(jì)算機(jī)軟件。,因?yàn)槭欠穹蛛x到腸桿菌科的不確定性,所以API 20E和API20NE同時(shí)使用。據(jù)推測,來自雌性海龜陰道的腸道致病菌可能會(huì)在產(chǎn)卵期間轉(zhuǎn)移到海龜?shù)爸?。Microgen的檢測試劑盒作為一種替代測試。因?yàn)樗麄儾⒉恍枰獌蓚€(gè)單獨(dú)的鑒別(腸道和非腸道)檢測。

材料和方法:
海龜?shù)笆占?/span>

在2004,2005和2006年的8月和9月期間,從11個(gè)烏龜巢中共收集70只未孵化的,完整的蠵海龜?shù)?。所有的巢都在美國佐治亞吉柯島上完成孵育。海龜?shù)暗氖占谟左w出現(xiàn)后的3-5天后進(jìn)行,或開始孵化的70天后(足月孵化為60-70天)。海龜?shù)埃ê透C里的沙一起)被收集到儲(chǔ)存于室溫下的無菌紙袋中存放,并運(yùn)往美國佐治亞州,薩凡納,阿姆斯特朗大西洋州立大學(xué)進(jìn)行處理。海龜?shù)暗募庸ぬ幚磉^程在2~4小時(shí)之內(nèi)完成。來自健康的巢穴(受控巢穴)的蛋不能被收集,因?yàn)檫@與受到威脅的物種--海龜是對(duì)立的。

細(xì)菌的分離和鑒定
每個(gè)巢隨機(jī)抽取3~6個(gè)海龜?shù)坝糜诩?xì)菌的分離。接著,除去蛋表面的巢沙。使用無菌棉簽轉(zhuǎn)移和分離的蛋表面的細(xì)菌。為了確定與胚胎液相關(guān)的細(xì)菌群體,蛋首先浸沒在過氧化氫中5分鐘,接著浸入95%乙醇中3分鐘以消毒。再用聚維酮碘消毒蛋的表面,用無菌剪刀和鑷子移除一塊蛋殼。
用無菌棉簽或無菌巴斯德吸液管來獲取胚胎流體樣品。被分離的細(xì)菌使用區(qū)域劃線隔離技術(shù),生長在(TSA)和(MA)培養(yǎng)基上,30℃下、24~48 h。分離的細(xì)菌均保存在TSA和MA瓊脂斜面上。革蘭氏染色使用Hucker染色法、孢子染色使用謝弗弗爾頓染色法(Murray等al.1994)。

生化方法

分離株的生化鑒定使用市售的微型多測試識(shí)別系統(tǒng):API(Biomerieux)及Microgen(Microbiology International)。接種每個(gè)鑒定系統(tǒng)之前,每個(gè)分離株都來自于一個(gè)24h TSB培養(yǎng)后重新接種到TSA平板上獲得的用于測試目的單獨(dú)菌落。


API 20E
    API 20E鑒定系統(tǒng)是專為鑒定腸桿菌科細(xì)菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性菌成員的測試條。
測試條根據(jù)提供的說明進(jìn)行接種和培養(yǎng)。無菌0.85%鹽溶液作為陰性對(duì)照,而變形桿菌作為陽性對(duì)照。采用API網(wǎng)絡(luò)軟件進(jìn)行鑒定,并且當(dāng)鑒定結(jié)果符合率在80%或更好時(shí)被認(rèn)為是可以接受的。(Biomerieux)。

API 20NE

API 20E鑒定系統(tǒng)是專為鑒定非苛養(yǎng),非腸道革蘭氏陰性菌成員的測試條。根據(jù)提供的說明進(jìn)行接種和培養(yǎng)。無菌0.85%鹽溶液作為陰性對(duì)照,而綠膿桿菌作為陽性對(duì)照。采用API網(wǎng)絡(luò)軟件進(jìn)行鑒定,并且當(dāng)鑒定結(jié)果符合率在80%或更好時(shí)被認(rèn)為是可以接受的。(Biomerieux)。

API CHB/E
API CHB/E鑒定系統(tǒng)是用于鑒定芽孢桿菌及其相關(guān)屬。它還用于屬于腸桿菌科細(xì)菌的革蘭氏陰性桿菌和弧菌家族的鑒定。測試條根據(jù)提供的說明書來接種與培養(yǎng)。采用API網(wǎng)絡(luò)軟件進(jìn)行鑒定,并且當(dāng)鑒定結(jié)果符合率在80%或更好時(shí)被認(rèn)為是可以接受的。(Biomerieux)。

Microgen GN A and GN B
Microgen GN A是最常遇到的腸桿菌科成員12種反應(yīng)底物固化的鑒定系統(tǒng)。GN A + B系統(tǒng)是目前公認(rèn)的非發(fā)酵,革蘭陰性桿菌,加氧化酶陰性腸桿菌科的所有物種的綜合識(shí)別系統(tǒng)。它還確定了11個(gè)屬的氧化酶陽性,不苛養(yǎng),革蘭陰性桿菌屬。測試條根據(jù)說明書提供的指示來接種和培養(yǎng)。對(duì)于這兩項(xiàng)GN A和GNA+B測試,采用無菌0.85%生理鹽水作為陰性對(duì)照。而大腸桿菌和變形桿菌被用來作為陽性對(duì)照。鑒定結(jié)果通過使用Microgen鑒定系統(tǒng)獲得。

分子生物學(xué)方法
27個(gè)隨機(jī)挑選的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌株挑染到TSA平板上,然后轉(zhuǎn)接到微生物鑒定Accugenix上。Accugenix的鑒定系統(tǒng)是基于16S rDNA序列和自動(dòng)化核糖分型(Accugenix2007年)的聯(lián)合。用于遺傳分析選定的分離菌株均來自從2005年筑巢季節(jié)期間收集的海龜?shù)爸小?/span>

結(jié)果

API與Microgen的比較

比較采用31株菌株API與Microgen的鑒定情況,API 20NE系統(tǒng)鑒定了28株(90%),API 20E系統(tǒng)鑒定了18株(58%)和Microgen系統(tǒng)鑒定了31株(100%)(見表1)。
然而,只有65%的菌株經(jīng)由API 20NE系統(tǒng)和26%菌株經(jīng)由的API 20E系統(tǒng)鑒定分離被認(rèn)為是可接受的(鑒定概率等于80%或更高)。同樣,雖然100%的菌株經(jīng)由Microgen確定,但也只有68%的鑒定是(高于80%)可以接受的。相比較結(jié)果,在API 20NE與Microgen之間產(chǎn)生了一個(gè)52%的鑒定差異,而在API 20E與Microgen之間產(chǎn)生了78%的鑒定差異。然而,當(dāng)Microgen的數(shù)據(jù)API20NE和API20E合并后的數(shù)據(jù)相比,這種鑒定差距下降到38%,即確定了12株由Microgen識(shí)別而API20NE或API20E兩者之一單獨(dú)無法鑒別的菌株被鑒定。仔細(xì)觀察顯示一直有差異的12個(gè)菌株的鑒定數(shù)據(jù),兩個(gè)API的數(shù)據(jù)庫對(duì)其中的3株菌株表現(xiàn)出完全沒有數(shù)據(jù)??紤]到這一點(diǎn),Microgen的結(jié)果和聯(lián)合的API結(jié)果之間的差異,下降到29%。Microgen的鑒定,因此,配合API的兩個(gè)測試最終可以鑒定71%的菌株。API 20E和API 20NE之間的鑒定差異是比較高的(83%)。綠膿桿菌和蒼白桿菌是唯一經(jīng)由 API20NE和API20E同時(shí)鑒定的菌株。通過兩種方法正確的操作鑒定過程是嚴(yán)受到格控制的。

API 與Accugenix的比較

相比較API和Accugenix用于革蘭氏陰性菌株的鑒定,API鑒定了86%的測試菌株,而Accugenix只鑒定了66%(見表2)。API鑒定系統(tǒng)能夠識(shí)別所有的測試菌株到屬、種的水平。而通過Accugenix鑒定的66%的菌株中,86%被確定到種,14%只能確定到屬。通過Accugenix系統(tǒng),共有7株菌株不能被識(shí)別,其中四株給出了匹配為最接近可能的鑒定結(jié)果,而另三株則完全無法識(shí)別。API與Accugenix鑒定結(jié)果的比較產(chǎn)生了出了72%的鑒定差異。菌株J66UH2F4通過APi鑒定為:嗜麥寡養(yǎng)單胞菌,而通過Accugenix鑒定為:彎曲假單胞菌。通過審查表型分支樹表明,這兩種生物體的密切相關(guān)性只有(1.52%)。而當(dāng)不能給出鑒定數(shù)據(jù)時(shí),Accugenix將提供最接近的相關(guān)鑒定。但在所有情況下,即使是最接近的鑒定結(jié)果也無法與API的鑒定結(jié)果相吻合。

表1:革蘭陰性桿菌的細(xì)菌鑒定:API(20E和20NE)VS Microgen

樣品

API 20NE

API 20E

Microgen

J130UH1IS2

嗜水氣單胞菌

異型枸櫞酸桿菌

異型枸櫞酸桿菌

J130UH1OS2

糞產(chǎn)堿桿菌

綠膿桿菌

糞產(chǎn)堿桿菌

J130UH1OS5

綠膿桿菌

青紫色素桿菌

綠膿桿菌

J130UH1OS6

糞產(chǎn)堿桿菌

Bordatella/產(chǎn)堿桿菌/莫拉氏菌

糞產(chǎn)堿桿菌

J130UH1OS8

綠膿桿菌

沒有ID

綠膿桿菌

J130UH2IS2

反硝化產(chǎn)堿桿菌

熒光假單胞菌/惡臭假單胞菌

木糖氧化產(chǎn)堿菌

J130UH2OS5

反硝化產(chǎn)堿桿菌

沒有 ID

莫拉氏菌.SP

J130UH3IS7

嗜水氣單胞菌

異性枸櫞酸桿菌

異性枸櫞酸桿菌

J130UH3OS7

希瓦氏菌putrifaciens

沒有 ID

希瓦氏菌putrifaciens

J130UH3OS10

糞產(chǎn)堿桿菌

沒有 ID

糞產(chǎn)堿桿菌

J130UH4IS1

嗜水氣單胞菌

異型枸櫞酸桿菌

異型枸櫞酸桿菌

J130UH4IS2

嗜水氣單胞菌

異型枸櫞酸桿菌

異型枸櫞酸桿菌

J130UH4OS1

食醇鞘氨醇桿菌*

沒有 ID

動(dòng)物潰瘍威克斯菌

J130UH5IS3

綠膿桿菌

綠膿桿菌

綠膿桿菌

J130UH5IS6

綠膿桿菌

綠膿桿菌

綠膿桿菌

J130UH5IS12

蒼白桿菌*

蒼白桿菌*

施氏假單胞菌

J130UH5OS3(1)

沒有 ID

沒有 ID

彭氏變形桿菌

J130UH5OS3(2)

蒼白桿菌*

沒有 ID

放線桿菌.sp!

J130UH5OS5

沒有 ID

沒有 ID

熒光假單胞菌

J130UH5OS6

沒有 ID

沒有 ID

熒光假單胞菌

J130UH6OS1

糞產(chǎn)堿桿菌

洋蔥假單胞菌

施氏假單胞菌

J131UH1IS3

少動(dòng)鞘氨醇單胞菌

沒有 ID

溶藻弧菌

J131UH1IS4

少動(dòng)鞘氨醇單胞菌

沒有 ID

施氏假單胞菌

J131UH1OS1

綠膿桿菌

綠膿桿菌

溶血產(chǎn)堿桿菌

J131UH1OS2

糞產(chǎn)堿桿菌

Bordatella/產(chǎn)堿桿菌/莫拉氏菌

惡臭假單胞菌

J131UH1OS3

糞產(chǎn)堿桿菌

沒有ID

糞產(chǎn)堿桿菌

J131UH1OS4

綠膿桿菌

綠膿桿菌

綠膿桿菌

J131UH1OS5

糞產(chǎn)堿桿菌

Bordatella/產(chǎn)堿桿菌/莫拉氏菌

糞產(chǎn)堿桿菌

J131UH2IS4

糞產(chǎn)堿桿菌

洋蔥假單胞菌

糞產(chǎn)堿桿菌

J131UH3OS2

變形桿菌

沒有ID

變形桿菌

J131UH6OS1

糞產(chǎn)堿桿菌

熒光假單胞菌/惡臭假單胞菌

糞產(chǎn)堿桿菌

*:未在Mirogen的數(shù)據(jù)庫中。
!:未在API的數(shù)據(jù)庫中。

對(duì)于革蘭氏陽性菌株,API只能鑒定出6株測試菌株中的2株(33%)(表3)。而Accugenix鑒定出了全部的6株。但其中一株[J66UH3OS(1)]產(chǎn)生了多重的鑒定結(jié)果,并且另外還有三株只能被鑒定到屬的水平(表3)。總體而言,相比較于Accugenix系統(tǒng)的檢出率70%(單獨(dú)菌株被檢出多重的鑒定結(jié)果被視作為:NO ID),API系統(tǒng)對(duì)于總測試菌株樣品檢出率達(dá)到了74%。最大的差異發(fā)生于革蘭氏染色陽性菌株鑒定中,數(shù)據(jù)結(jié)果的比較在兩種檢測方法之間產(chǎn)生了一個(gè)74%的差異。通過兩種方法正確的操作鑒定過程是受到嚴(yán)格控制的。

討論
    在試圖確定將來自壞死蠵海龜?shù)爸协h(huán)境細(xì)菌的分離鑒定最有效果和有效率的方法,我們比較和評(píng)估了一項(xiàng)為期三年跨度的三個(gè)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。在我們研究的第一年,細(xì)菌分離株通過使用API 20E、API 20NE與API CHB/E鑒定系統(tǒng)來鑒定。API系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于整個(gè)美國并且作為一項(xiàng)“金標(biāo)準(zhǔn)”被其它的鑒定系統(tǒng)作為比較對(duì)象。雖然,已有眾多的研究針對(duì)臨床菌株進(jìn)行了API與其它市售鑒定系統(tǒng)的比較,但只有少數(shù)研究進(jìn)行了環(huán)境中分離株的API與其它方法的鑒定比較。(Brown and Leff 1996;Johnsen et al.1996;Toti et al.1996; Truu et al.1999;Israil et al.2003)。為了確定的API系統(tǒng)用于鑒定與蠵海龜?shù)跋嚓P(guān)聯(lián)的環(huán)境細(xì)菌的作用,我們用API與其它的鑒定系統(tǒng)做了比較。由于涉及16S rRNA基因測序的分子生物學(xué)方法,現(xiàn)在經(jīng)常使用的細(xì)菌鑒定,從第二年數(shù)據(jù)分離株隨機(jī)被取用于16S rRNA序列分析鑒定與API系統(tǒng)相比較。

 

表2:革蘭陰性菌株的細(xì)菌鑒定:API(20E和20NE)VS  Accugenix

樣品

API鑒定

Accugenix鑒定

J66UH1F1

粘質(zhì)沙雷氏菌

粘質(zhì)沙雷氏菌

J66UH1F4

洋蔥假單胞菌

河流弧菌

J66UH2F4

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌

假單胞菌geniculata

J66UH2F5

蒼白桿菌

缺陷短波單胞菌

J66UH2OS4

嗜水氣單胞菌

粘質(zhì)沙雷氏菌

J66UH3F1

NO ID

缺陷短波單胞菌

J66UH3OS1

糞產(chǎn)堿桿菌

糞產(chǎn)堿桿菌

J66UH3OS5

糞產(chǎn)堿桿菌

糞產(chǎn)堿桿菌

J66UH5F2(1)

綠膿桿菌

綠膿桿菌

J66UH5F2(2)

熒光假單胞菌

綠膿桿菌

J66UH5F3

食醇鞘氨醇桿菌

無匹配(11.13%相關(guān))

J66UH5OS1

陰溝腸桿菌

無匹配(水氏黃桿菌)

J66UH3OS1

NO ID

無匹配(水氏黃桿菌)

J80UH1F1

淺黃金色單胞菌

無匹配(腸桿菌屬)

J80UH3OS2

熒光假單胞菌

假單胞菌屬

J80UH1F2(1)

希瓦氏菌屬putrifaciens

希瓦氏菌屬alage

J80UH1F2(2)

食醇鞘氨醇桿菌

無匹配(11.80%相關(guān)性)

J80UH2OS2

少動(dòng)鞘氨醇單胞菌

根瘤菌屬

J73UH4F2

NO ID

無匹配(腸桿菌屬)

J73UH2F1

多食鞘氨醇桿菌

無匹配(19.31%相關(guān)性)

J73UH3F4

木糖氧化產(chǎn)堿菌

木糖氧化無色桿菌

 

表3:革蘭氏陽性菌株的細(xì)菌鑒定:API(CHB/E) VS  Accugenix

 

樣品

API 鑒定

Accugenix 鑒定

J52UH5F1

No ID

蠟樣芽胞桿菌組

J66UH5OS2

巨大芽孢桿菌

芽孢桿菌

J66UH3OS3(1)

No ID

棒狀桿菌hoagii或馬紅球菌

J66UH5OS5

短芽孢桿菌

芽孢桿菌。

J66UH1F2(1)

No ID

微桿菌maritypicum或
液化微桿菌或氧化微桿菌

J73UH3F1

No ID

紅球菌zopfii

 

作為一個(gè)額外的比較,我們拿API與另一個(gè)較新的生化系統(tǒng)(Microgen GN A和GNB鑒定試劑條)進(jìn)行對(duì)比,在我們研究的第三個(gè)年頭。當(dāng)比較和評(píng)估這三種方法時(shí),以下的因素都被考慮:鑒定分離株的能力、用其他方法確證數(shù)據(jù)、成本、易用性、網(wǎng)絡(luò)資源/指令、和數(shù)據(jù)庫/計(jì)算機(jī)軟件。 

鑒定分離株的能力和用其他方法確證鑒定
    由于使用未知的環(huán)境分離株其鑒定的準(zhǔn)確性難以確保,我們在鑒定方法之間通過他們鑒定分離菌株的能力以及鑒定的證據(jù)來評(píng)估我們的所使用的方法。在API與Accugenix方法之間進(jìn)行數(shù)據(jù)的比較,得出了一個(gè)高水平的差異(74%)??偟膩碚f,這兩種方法在鑒定分離株(API的74%;Accugenix 70%)方面可以相媲美,,但用來識(shí)別革蘭氏陰性VS革蘭氏陽性分離株時(shí),存在性能上的差異。API能夠鑒定更多的革蘭氏陰性分離株(86%)相比較Accugenix的(66%)。但是Accugenix能夠鑒定更多的革蘭氏陽性菌株(100%)相比較API的(33%)。

高水平的API和Accugenix鑒定之間的差異是難以解釋的,但可能是因?yàn)槿狈Νh(huán)境分離株數(shù)據(jù)庫中的收錄信息部分。純培養(yǎng)過程不是可能引起樣品鑒定差異的原因。因?yàn)榫暌恢北惶羧『椭匦路蛛x以保持純度。
    API 20E和API 20NE系統(tǒng)鑒定86%的革蘭陰性分離株相比API CHB/ E系統(tǒng),只有33%的革蘭氏陽性分離株被鑒定。這表明,API 20E和API 20NE系統(tǒng)進(jìn)行鑒定環(huán)境分離株比API CHB/ E系統(tǒng)更好。由于API CHB/ E系統(tǒng)是專門設(shè)計(jì)來鑒定芽孢桿菌和相關(guān)屬的,這也許可以解釋一些差異和低識(shí)別率觀察。

API 20NE、API 20E和Microgen比較表明Microgen可能是一個(gè)更可靠的系統(tǒng)。Microgen鑒定了所有分離菌株(100%)與API的20NE和20E聯(lián)合使用鑒定了(90%)相比。此外,71%的API 20E和API 20NE相結(jié)合的菌株鑒定數(shù)據(jù)被Microgen鑒定所證實(shí)。Microgen高的鑒定百分率可以歸因于Microgen的編號(hào)系統(tǒng)提供一個(gè)更廣泛的數(shù)據(jù)庫。雖然API 20E和20NE系統(tǒng)的設(shè)計(jì),主要用于臨床和食品分離株使用,Microgen的數(shù)據(jù)庫中聲稱,結(jié)合臨床,食品,環(huán)境和獸醫(yī)數(shù)據(jù)。不完整的數(shù)據(jù)庫,也可考慮為差異的一個(gè)部分。例如,鞘脂桿菌屬 spiritivorum和蒼白桿菌屬 anthropi不是Microgen的數(shù)據(jù)庫中的一部分,和放線菌屬,不是API的數(shù)據(jù)庫中的一部分。

 正如預(yù)期的那樣,我們的數(shù)據(jù)表明,API 20NE比API 20E能更好地適應(yīng)鑒定環(huán)境分離株。Toti等人(1996年)和Israil等人(2003)也指出,針對(duì)環(huán)境樣品的分析,API的20NE系統(tǒng)比API20E系統(tǒng)提供了一個(gè)更高分辨率的正確鑒定。API系統(tǒng)的限制是一個(gè)不爭的事實(shí)
,革蘭陰性桿菌的鑒定需要確定是否腸道或非腸道分離菌的信息支持。如果沒有這些信息,環(huán)境分離株需要的API20E和API20NE系統(tǒng)各自的性能去鑒定。兩次測試之間的鑒定差異經(jīng)常出現(xiàn),互相混淆,尤其是當(dāng)每個(gè)測試標(biāo)識(shí)出分離株的一個(gè)高百分比概率。而這個(gè)問題沒有發(fā)生在Microgen系統(tǒng)上,因?yàn)檫@兩個(gè)條旨在配合工作,因?yàn)檫@兩個(gè)測試條旨在配合工作,只需其中一個(gè)條確證所需鑒定的生物體是否氧化酶陰性。
 

成本分析
    估計(jì)成本,鑒定一個(gè)分離株如下:
API 20E為7.16;API 20NE為$5.66;Microgen GN-A為$3.33;Microgen GNB為$4.17;Accugenix為$ 75.00~$31500根據(jù)周轉(zhuǎn)周期而定?;驕y試與生化鑒定系統(tǒng)相比被證明是非常昂貴的,是不現(xiàn)實(shí)的。在有限的資源條件下。Microgen系統(tǒng)的研究方案是較API系統(tǒng)便宜的,但如果API系統(tǒng)可獲得折扣,便可使這兩個(gè)系統(tǒng)的成本可比。

易于使用
    試劑盒的研制,接種準(zhǔn)備,接種程序比較表明,Microgen比API系統(tǒng)更容易使用。Microgen測試條相比較API的測試條,減少了它約一半的準(zhǔn)備和接種的時(shí)間。Microgen(Microgen的一個(gè)培養(yǎng)溫度相比較API設(shè)置的2個(gè)培養(yǎng)溫度),培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)也簡單。分子生物學(xué)使用方法不包括在這次比較中,因?yàn)榫觇b定實(shí)驗(yàn)不是在我們的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的。

說明/ Web資源
總體而言,Microgen的說明書和網(wǎng)絡(luò)資源比API的信息更詳細(xì),更易于使用,并提供更多的信息。
 

API網(wǎng)絡(luò) VS Microgen識(shí)別系統(tǒng)
    Api網(wǎng)絡(luò)提供物種鑒定和表型概率的索引(配置文件的字符)。它總是一個(gè)完整的生物化學(xué)檢測清單,和1至4個(gè)額外的測試組成。Microgen ID軟件提供在線的應(yīng)用手冊和連接到Microgen網(wǎng)站的鏈接。該軟件提供五個(gè)最可能的鑒定選擇、可能性、鑒定概率、及每一個(gè)選擇的分化程度。它還提供了三個(gè)異常反應(yīng)和最多五個(gè)額外的測試,以便進(jìn)一步區(qū)分。最新的名稱上的變化和分類的起源也包括在內(nèi)。

與所有其它的鑒定方法一樣,測試系統(tǒng)沒有100%準(zhǔn)確或可靠的。測試鑒定系統(tǒng)的局限性包括:不完整的計(jì)算機(jī)化的數(shù)據(jù)庫,數(shù)據(jù)庫的準(zhǔn)確性,來源菌株進(jìn)行測試(臨床,分子食物或環(huán)境)和核酸的提取方法。

 我們的研究結(jié)果表明,生化代謝分析可以有效地用來識(shí)別特定的環(huán)境細(xì)菌分離。雖然所有三種方法細(xì)菌鑒定都是可行的方案,但是生化方法更便宜,更容易使用,提供快速的結(jié)果,不需要使用專門的設(shè)備和分子生物學(xué)方法所需的程序。這是特別重要的,尤其當(dāng)試圖分離和鑒定大量細(xì)菌需要在一個(gè)很短的時(shí)間內(nèi)完成時(shí)。生化方法也允許我們建立一個(gè)菌株代謝概況特點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫。McRoy和Seidler(1973年),Siebeling等。(1975年),阿庫納等(1999)和迪亞茲等人(2006)還利用生化檢測,識(shí)別與龜相關(guān)的微生物種群。

 系統(tǒng)測試兩個(gè)生化方法中,Microgen似乎是最適合用于鑒定海龜?shù)暗沫h(huán)境分離菌株。
API和Microgen成本相媲美,但Microgen系統(tǒng)被證明使用是更簡單的,相比API 20E和API 20NE有最高的確證鑒定比例。微生物學(xué)國際(2002)進(jìn)行的一項(xiàng)研究也指出了類似的結(jié)果。Microgen ID系統(tǒng)是一個(gè)相對(duì)簡單和成本效益好的用于某些生態(tài)檢測的鑒定系統(tǒng),非常適合面對(duì)小和/或有限的資源的大學(xué)和研究實(shí)驗(yàn)室。

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