中國(guó)工程院食品安全院士團(tuán)隊(duì)

科研成果轉(zhuǎn)化平臺(tái)

微生物燃料電池（MFC）傳感器是一種自再生、通用性強(qiáng)的平臺(tái)，可開(kāi)發(fā)低成本、易用的分析設(shè)備，替代繁瑣且昂貴的傳統(tǒng)技術(shù)。MFC傳感器利用電活性細(xì)菌（EAB）通過(guò)細(xì)菌與電極之間的細(xì)胞外電子轉(zhuǎn)移EET將分析物轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，多以陽(yáng)極模式運(yùn)行，并通過(guò)干擾EAB代謝實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，但受限于代謝響應(yīng)速度和底物依賴(lài)性，難以應(yīng)用于低有機(jī)物環(huán)境。而反向EET可使細(xì)菌從陰極獲取電子進(jìn)行還原反應(yīng)，效率高且與代謝無(wú)關(guān)?；诖擞醒芯繉腋AB細(xì)胞作為傳感元件，構(gòu)建了全細(xì)胞生物陰極傳感器，靈敏度高并簡(jiǎn)化了制備過(guò)程。當(dāng)目標(biāo)分析物可被特定酶感知時(shí)，該傳感器還具有高選擇性。但反向EET驅(qū)動(dòng)的生物陰極反應(yīng)通常在較低電極電位下進(jìn)行（低于-0.56 V，相對(duì)于SCE），直接用MFC陽(yáng)極驅(qū)動(dòng)在熱力學(xué)上不利，而采用三電極系統(tǒng)則與自供能特性相沖突。

將光電極與MFC集成已被驗(yàn)證可以顯著提高M(jìn)FC的性能，光陽(yáng)極有望驅(qū)動(dòng)生物陰極傳感器，但與酶?jìng)鞲衅飨啾龋?xì)胞生物陰極傳感器的電子傳輸路徑更為復(fù)雜，可能涉及一系列具有不同氧化還原電位的電子傳輸?shù)鞍?。并且由于生物陰極在相對(duì)較低的電極電位下運(yùn)行，必須避免諸如氧氣還原和氫氣生成等副反應(yīng)。因此，制備一個(gè)具有適當(dāng)光電化學(xué)特性的光陽(yáng)極以匹配生物陰極的動(dòng)力學(xué)至關(guān)重要，這為開(kāi)發(fā)自供能、高效的全細(xì)胞生物陰極傳感器奠定了基礎(chǔ)。在本研究中，顧崢等人首次開(kāi)發(fā)了一種用于硝酸鹽檢測(cè)的自驅(qū)動(dòng)全細(xì)胞生物陰極傳感器。

1、研究思路與方法：

A. 生物陰極的構(gòu)建
使用缺乏表達(dá)亞硝酸鹽還原酶NrfA能力的希瓦氏菌（Shewanella oneidensis MR-1）作為生物催化劑，并補(bǔ)充乳酸鈉作為電子供體加速硝酸鹽的消耗并顯著縮短檢測(cè)時(shí)間。還通過(guò)添加1-羥基苯并菲（1-OH phenazine）、中性紅（NR）、核黃素（RF）等物質(zhì)作為可溶性電子穿梭體，優(yōu)化生物陰極的性能。

B. In?O?/In?S?光陽(yáng)極的制備與表征
商業(yè)FTO電極乙醇和去離子水清洗后放入聚四氟乙烯襯里的不銹鋼高壓釜中，加入前驅(qū)液（含In(NO?)?和NaNO?），經(jīng)加熱、沖洗、干燥和煅燒后得到In?O?修飾的FTO電極（In?O?@FTO）。隨后使用L-半胱氨酸作為硫源對(duì)In?O?@FTO進(jìn)行硫化處理，制備In?O?/In?S?光陽(yáng)極。最后使用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡、X射線(xiàn)衍射和X射線(xiàn)光電子能譜、紫外-可見(jiàn)漫反射光譜（UV–vis DRS）以及線(xiàn)性?huà)呙璺卜ǎ↙SV）觀察所制備光陽(yáng)極的形貌、晶體結(jié)構(gòu)和組成、光吸收能力、光電化學(xué)特性。

C. 生物陰極傳感器的組裝與測(cè)試
將光陽(yáng)極與生物陰極通過(guò)短路連接，構(gòu)建了一個(gè)自供能的生物傳感器。陽(yáng)極液為0.1 M Na?SO?，陰極液為含有M9培養(yǎng)基、18 mM乳酸鈉和2 μM 1-羥基苯并菲的細(xì)菌懸浮液。通過(guò)光照驅(qū)動(dòng)光陽(yáng)極產(chǎn)生電流，進(jìn)而為生物陰極提供電子，實(shí)現(xiàn)對(duì)硝酸鹽的還原檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)向生物陰極室中添加不同濃度的硝酸鹽溶液，記錄電流響應(yīng)，評(píng)估傳感器的性能。

2、研究結(jié)果：

A. 生物陰極對(duì)硝酸鹽還原的動(dòng)力學(xué)特性：

圖 1 希瓦氏菌（Shewanella oneidensis MR-1）細(xì)胞對(duì)硝酸鹽還原的循環(huán)伏安特性曲線(xiàn)

本研究構(gòu)建了一個(gè)由碳布電極和細(xì)菌懸浮液組成的生物陰極，并在10 mM硝酸鹽存在下進(jìn)行循環(huán)伏安（CV）分析，以促進(jìn)細(xì)胞外電子傳遞（EET）。如圖1所示，僅在細(xì)菌細(xì)胞存在時(shí)無(wú)法區(qū)分明顯的氧化還原峰，但當(dāng)加入硝酸鹽后，出現(xiàn)了還原電流，表明即使懸浮的細(xì)菌細(xì)胞也能進(jìn)行硝酸鹽還原的反向電子傳遞。加入可溶性電子穿梭體后，觀察到可逆的氧化還原峰，其表觀標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位分別為-0.613 V（中性紅，NR）、-0.492 V（核黃素，RF）和-0.472 V（1-羥基苯并菲，POH）。如預(yù)期所示，當(dāng)向生物陰極中加入硝酸鹽（nitrate）時(shí)，可逆峰轉(zhuǎn)變?yōu)镾型，陰極電流顯著增加。這些結(jié)果證實(shí)了電子穿梭體有效地增強(qiáng)了硝酸鹽還原速率并降低了過(guò)電位。與NR和RF相比，POH介導(dǎo)的硝酸鹽還原顯示出更正的起始電位，并且還原電流高于NR。更重要的是，這一起始電位非常接近希瓦氏菌中硝酸鹽還原酶的熱力學(xué)限制。因此，POH被選為后續(xù)研究的最佳電子穿梭體。

B. 光陽(yáng)極的性能：

圖 2 光驅(qū)動(dòng)生物陰極傳感器的光電化學(xué)特性及對(duì)硝酸鹽的響應(yīng)分析

通過(guò)UV–vis DRS測(cè)量光陽(yáng)極的光吸收能力，發(fā)現(xiàn)In?O?/In?S?光陽(yáng)極在可見(jiàn)光區(qū)域具有廣泛吸收范圍，最大吸收在500 nm以下。如圖2a，LSV分析表明，In?O?/In?S?-3光陽(yáng)極表現(xiàn)出較低的起始電位（-0.9 V）和較大的陽(yáng)極電流（277 μ[email protected] V），優(yōu)于In?O?/In?S?-5。此外，In?O?/In?S?-3在無(wú)光照時(shí)僅產(chǎn)生背景電流，表明其光電化學(xué)特性顯著，可為生物陰極提供動(dòng)力?；诖?，通過(guò)短路連接In?O?/In?S?-3光陽(yáng)極和生物陰極，構(gòu)建了雙室光驅(qū)動(dòng)生物陰極還原系統(tǒng)。如圖2b，在有光照但無(wú)硝酸鹽時(shí)，背景電流迅速衰減至<1 μA，表明副反應(yīng)可忽略；加入10 μM硝酸鹽后，電流響應(yīng)迅速上升后逐漸衰減，表明反向電子傳遞成功建立且硝酸鹽被消耗。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，加入更高濃度硝酸鹽（30 μM和50 μM）時(shí)，電流響應(yīng)趨勢(shì)類(lèi)似，但加入10 μM硝酸鹽時(shí)的峰值電流更高。

如圖2c，在三電極體系中，生物陰極對(duì)硝酸鹽的安培響應(yīng)趨勢(shì)與光驅(qū)動(dòng)生物陰極相似，但峰值電流略有差異。如圖2d，研究者通過(guò)另一個(gè)電化學(xué)工作站同時(shí)測(cè)量了光驅(qū)動(dòng)生物陰極還原過(guò)程中生物陰極的電極電位，發(fā)現(xiàn)生物陰極電位對(duì)硝酸鹽添加表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)響應(yīng)。無(wú)硝酸鹽時(shí)穩(wěn)定在約-0.84 V，加入硝酸鹽后電位正向移動(dòng)。這表明光陽(yáng)極供電負(fù)擔(dān)低，硝酸鹽還原加速導(dǎo)致光陽(yáng)極過(guò)電位增大，電極電位正向移動(dòng)。因此，整個(gè)系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)瓶頸在于光陽(yáng)極，生物陰極在一定濃度范圍內(nèi)可高效還原硝酸鹽，為定量分析奠定了基礎(chǔ)。

C. 傳感器的開(kāi)發(fā)：

圖 3 光驅(qū)動(dòng)生物陰極傳感器對(duì)硝酸鹽劑量的電流響應(yīng)

生物傳感器由LED驅(qū)動(dòng)的In?O?/In?S?-3光陽(yáng)極、MR-1懸浮液生物陰極和碳布電極組成。在無(wú)硝酸鹽時(shí)記錄背景電流，穩(wěn)定后注入硝酸鹽水樣并記錄電流變化。如圖3a，低至0.1 μM的硝酸鹽即可引起即時(shí)電流響應(yīng)，且單次檢測(cè)僅需幾十到幾百秒，遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)生物陽(yáng)極傳感器（需近1小時(shí)）。

如圖3b和3c所示，隨著硝酸鹽濃度增加，峰值電流在0.1–20 μM范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，靈敏度為5.32 μA μM?1，檢測(cè)限為0.028 μM。當(dāng)濃度超過(guò)50 μM時(shí)，峰值電流趨于飽和（150 μM時(shí)為178 μA），這可能是由于光陽(yáng)極和生物陰極的動(dòng)力學(xué)限制。與傳統(tǒng)方法相比，該傳感器具有更高的靈敏度和更低的檢測(cè)限。

D. 生物傳感器的檢測(cè)性能

在應(yīng)用于實(shí)際樣品測(cè)試之前，本研究對(duì)所開(kāi)發(fā)的生物傳感器的選擇性、可重復(fù)使用性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性進(jìn)行探究。

a) 選擇性：研究發(fā)現(xiàn)在高濃度（1 mM）的常見(jiàn)陰離子（氯離子、硫酸根離子、碳酸根離子）存在下，電流響應(yīng)變化小于1 μA，表明傳感器對(duì)硝酸鹽具有良好的選擇性。即使在亞硝酸鹽存在時(shí)，通過(guò)基因敲除亞硝酸鹽還原酶（ΔnrfA），傳感器對(duì)硝酸鹽的選擇性顯著提高，響應(yīng)電流主要反映硝酸鹽的濃度。

b) 可重復(fù)使用性：連續(xù)10次測(cè)量10 μM硝酸鹽水樣時(shí)，電流響應(yīng)略有衰減，可能是由于光陽(yáng)極的部分光腐蝕。在4°C下儲(chǔ)存光陽(yáng)極30天，未觀察到電流響應(yīng)衰減，表明光陽(yáng)極具有良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

c) 準(zhǔn)確性和重復(fù)性：通過(guò)向水樣中添加1–15 μM硝酸鹽進(jìn)行測(cè)試，回收率為91.5%–111%，變異系數(shù)（CV）為0.7%–8.8%，表明傳感器具有高準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

3、實(shí)際應(yīng)用

將生物傳感器應(yīng)用于生物反應(yīng)器水樣的檢測(cè)，結(jié)果與傳統(tǒng)比色法一致（偏差小于10%），表明該傳感器具有良好的抗干擾能力和實(shí)際應(yīng)用潛力。

4、創(chuàng)新點(diǎn)

1、開(kāi)發(fā)了一種用于硝酸鹽檢測(cè)的光驅(qū)動(dòng)全細(xì)胞生物陰極傳感器。
2、In?O?/In?S?光陽(yáng)極高效驅(qū)動(dòng)生物陰極，并與其動(dòng)力學(xué)特性相匹配。
3、生物陰極電位能夠動(dòng)態(tài)響應(yīng)不同劑量的硝酸鹽。
4、實(shí)現(xiàn)了0.1–20 μM的線(xiàn)性檢測(cè)范圍和0.028 μM的檢測(cè)限。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.136761

文章來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~梁冬雪。