通過噬菌體長尾纖維蛋白固定磁性納米粒子，實(shí)現(xiàn)快速、超靈敏檢測沙門氏菌
發(fā)布時間：2024-09-02 瀏覽次數(shù)：36
目前比較實(shí)用的檢測技術(shù)中，實(shí)時熒光定量PCR應(yīng)用范圍最廣。然而，來自食物基質(zhì)的抑制因素和細(xì)菌水平的初始低豐度會影響qPCR的效果。常用的解決方案是富集培養(yǎng)，但培養(yǎng)時間較長，還會出現(xiàn)初始細(xì)胞的損失等現(xiàn)象。因此，在qPCR分析之前，應(yīng)采用有效且可靠的方式從受污染的食品樣品中分離和富集細(xì)菌細(xì)胞；而磁性納米粒子(MNPs)可有效富集靶細(xì)菌，靶細(xì)菌細(xì)胞的選擇性識別和結(jié)合通常通過MNP與特定適配子和抗體的功能化來實(shí)現(xiàn)。本文采用的方法是，用噬菌體尾部纖維蛋白(TFP)包裹MNP。因TFPs來源于噬菌體和細(xì)菌的共同進(jìn)化過程，因此編碼為對宿主菌株的特定識別，無需耗時且耗費(fèi)人力的篩選過程，且較容易大量生產(chǎn)。因此，TFPs具有巨大的潛力，可用作生物探針，與MNP一起功能化，用于靶細(xì)菌的特定分離和富集。
在這篇文章中，作者使用一株可感染多株沙門氏菌的噬菌體STP4-a，其長尾纖維蛋白(稱為LTF4-a)由形成STP4-a粘附尖端的亞基gp37和gp38組成；作者將gp37和gp38在大腸桿菌中共表達(dá)形成重組LTF4-a，然后將其功能化到MNP上以產(chǎn)生用于檢測沙門氏菌的生物探針，在復(fù)雜食品基質(zhì)中建立了一種快速且超靈敏的沙門氏菌檢測方法，該方法允許在3小時內(nèi)達(dá)到7 CFU / mL的檢測限。
重組LTF4-a的表征
圖1：蛋白LTF4-a的表征
A圖為表達(dá)載體的構(gòu)建，其中g(shù)p57A是長尾纖維形成伴侶，為了最大限度地提高gp38的宿主受體結(jié)合能力，在LTF4-a的N端加入6×His-tag和3賴氨酸帽，使用高純度的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功獲得重組LTF4-a蛋白，產(chǎn)量為6-8mg / L;B圖為表達(dá)蛋白的SDS-PAGE驗(yàn)證結(jié)果。
圖2：探究LTF4-a的結(jié)合能力
為了確定LTF4-a是否能夠結(jié)合沙門氏菌細(xì)胞，將FITC標(biāo)記的重組LTF4-a與鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028細(xì)胞一起孵育，并在熒光(FL)顯微鏡下檢查(圖2)。在FL顯微鏡下在鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028細(xì)胞上觀察到綠色熒光。
圖3：探究生物探針的細(xì)胞結(jié)合能力
為探究生物探針的細(xì)胞結(jié)合能力，將該生物探針和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028共孵育后，用TEM觀察細(xì)菌形態(tài)，如圖3所示。結(jié)果表明，該探針不會影響細(xì)菌形態(tài)，且可有效結(jié)合島細(xì)菌表面。
圖4：優(yōu)化生物探針的反應(yīng)條件
對LTF4-a-MNP生物探針的沙門氏菌細(xì)胞結(jié)合效率進(jìn)行優(yōu)化，分別從(1)LTF4-a-MNP的單反應(yīng)體積，(2)LTF4-a-MNP與沙門氏菌培養(yǎng)物的孵育時間，(3)反應(yīng)溶液的pH值，以及(4)反應(yīng)溶液中的NaCl濃度四個條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果如圖4所示，紅色柱子表示最佳的反應(yīng)條件。
對生物探針檢測特異性的探究，將所有測試用的細(xì)菌濃度調(diào)整一致，結(jié)果表明生物探針對沙門氏菌的回收效率不受到其他菌株的影響(圖5)。
圖5：探究生物探針的檢測特異性
評估生物探針在食物基質(zhì)中的效果，結(jié)果表明，該探針在牛奶、生菜、雞蛋中的細(xì)菌回收率幾乎為100%，且該探針在4℃下保存6個月后回收效率仍然保持高水平，即說明該探針可在4℃下保存數(shù)月。
圖6：探究生物探針在食品基質(zhì)中的作用效果
探究LTF4-a-MNP生物探針在實(shí)際應(yīng)用中的潛力。基于LTF4-a-MNP的分離和富集(A)PBS，(B)牛奶，(C)生菜和(D)全蛋樣品后，鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028分析的qPCR線性擬合曲線。其中，1：陰性對照，2：7 CFU/mL，3：101CFU/mL， 4： 102CFU / mL，5：103CFU/毫升，6：104CFU / mL，7：105CFU/mL。
根據(jù)qPCR結(jié)果，所有測試樣品的回歸曲線均具有良好的線性范圍，LOD值為7 CFU / mL，凝膠圖像表明PCR擴(kuò)增子的產(chǎn)生與沙門氏菌的濃度成正比。
圖7：生物探針在實(shí)際應(yīng)用中的作用效果
結(jié)論：本研究建立了一種快速、超靈敏的復(fù)雜食品基質(zhì)沙門氏菌檢測方法，檢測限為7 CFU/mL，檢測時間為3h，重組LTF4-a與MNP偶聯(lián)用作特異性親和配體，用于篩選來自不同食品樣品的沙門氏菌細(xì)胞，并與qPCR進(jìn)一步結(jié)合，用于從預(yù)濃縮樣品中特異性和靈敏檢測目標(biāo)微生物細(xì)胞。
參考文獻(xiàn)：Wang L, Lin H, Zhang J, Wang J. Phage long tail fiber protein-immobilized magnetic nanoparticles for rapid and ultrasensitive detection of Salmonella. Talanta. 2022 Oct 1;248:123627. doi: 10.1016/j.talanta.2022.123627. Epub 2022 May 30. PMID: 35661002.
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~王梓萌
