中國工程院食品安全院士團隊

科研成果轉(zhuǎn)化平臺

細胞培養(yǎng)過程中，細胞培養(yǎng)基是不可或缺的，細胞培養(yǎng)基既是培養(yǎng)細胞中供給細胞營養(yǎng)和促使細胞生殖增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。

通常細胞體外培養(yǎng)時需要加入血清，以維持細胞的生長和存活。而除了血清之外，部分細胞在培養(yǎng)過程中需要添加胰島素和β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）等成分來維持細胞狀態(tài)。MCF-7和NIH:OVCAR-3等細胞需要額外添加胰島素，而Thp-1和MC3T3-E1 subclone 14等細胞則需要添加β-巰基乙醇，不同細胞加入量會有差異，需根據(jù)細胞類型判斷。

同一種培養(yǎng)基也會因其添加物的不同而應(yīng)用于不同的細胞培養(yǎng)和不同的實驗需求，下面就詳細介紹下細胞培養(yǎng)基中各種添加劑的功能。

添加劑介紹

1、L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺（L-Glutamine）是細胞生長的必須氨基酸，可作為培養(yǎng)細胞的能量來源，參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中狀態(tài)不穩(wěn)定，它的降解速率隨保存時間，保存溫度及保存環(huán)境pH值等變化而變化。L-丙胺酰-谷氨酰胺（L-alanyl-L-glutamine）是細胞培養(yǎng)中廣泛使用的L-谷氨酰胺的替代品，其在水溶液中穩(wěn)定性高，即可保持長時間穩(wěn)定的營養(yǎng)供給，也降低了分解產(chǎn)物造成的細胞毒性。L-丙胺酰-谷氨酰胺溶液（L-alanyl-L-glutamine slution）可作為哺乳動物貼壁細胞或懸浮細胞培養(yǎng)添加劑。與谷氨酰胺相比，L-丙胺酰-谷氨酰胺不會自行降解成氨而導(dǎo)致細胞毒性，作為添加物培養(yǎng)條件更加可控，可有效提高細胞活力。

2、培養(yǎng)基中谷氨酰胺作用及使用方法？

幾乎所有的細胞對谷氨酰胺有較高的要求，細胞需要谷氨酰胺合成蛋白質(zhì)，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。所以，各種培養(yǎng)液中都含有較大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置-20℃ 冰凍保存，用前加入培養(yǎng)基中。加有谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基 4℃冰箱儲存兩周以上時，應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺。

3、GlutaMAX-I是什么?培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？

GlutaMAX-I 即谷丙氨酸二肽，是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的 alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

4、培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

細胞通常以葡萄糖作為碳源，丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源。如果沒有足夠的葡萄糖供應(yīng)，細胞就會選擇丙酮酸鈉作為代謝底物。丙酮酸是糖酵解途徑中一個中間產(chǎn)物，也是 EM（Embden Myerhoff）途徑的第一步，所以培養(yǎng)基中添加的丙酮酸既可以作為能量的來源也可以為細胞的代謝提供碳骨架。對于某些特殊的細胞，丙酮酸對維持細胞的生存是必需的，丙酮酸對于某些細胞的繁殖和低血清濃度的增殖也是必不可少。培養(yǎng)基中的丙酮酸鈉濃度一般是 0.1 mM，商品化的丙酮酸鈉一般是 10mM（100X） 的溶液。

丙酮酸鈉（Sodium Pyruvate）是最常見的丙酮酸鹽，是一類內(nèi)源性小分子物質(zhì)，丙酮酸鈉和丙酮酸均是天然存在于人體內(nèi)，并參與全身各組織和器官的代謝。丙酮酸鈉在醫(yī)學(xué)上、診斷試劑以及醫(yī)療器械中被廣泛用作緩沖劑、賦形劑和抗氧化劑。在人體中行動中大多數(shù)細胞只利用葡萄糖作為能量的物質(zhì)就夠了，而在細胞培養(yǎng)中丙酮酸鈉是必須的物質(zhì)。丙酮酸鈉在培養(yǎng)基中起到替代碳源的作用，參與細胞營養(yǎng)代謝。

5、Hank′s 平衡鹽溶液和 Earle′s 平衡鹽溶液有什么本質(zhì)功能差別？

HBS 和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在 Eagle′s（2.2g/L） 中比在 Hanks′（0.35g/L）中高。碳酸氫鈉需用高水平的 CO2 平衡，以維持溶液的 PH 值。Eagle′s 液在空氣水平的CO2中，溶液會變堿，Hanks′液在 CO2 培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagle′s液，如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks′液就可以了。

6、培養(yǎng)液pH對細胞生長的影響？

由于大多數(shù)細胞適宜pH為7.2-7.4，偏離此范圍可能對細胞生長將產(chǎn)生有害的影響。但各種細胞對pH的要求也不完全相同，原代培養(yǎng)細胞一般對pH變動耐受差，無限細胞系耐受力強。但總體來說，細胞耐酸性比耐堿性強一些。在配制培養(yǎng)用液時，需要注意一點：新配的培養(yǎng)基在經(jīng)過 0.10um 或 0.22um 濾膜過濾時，溶液的pH 還會向上浮動0.2左右。 

7、培養(yǎng)細胞時應(yīng)使用5%還是10%CO2，或者根本沒有影響？

一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3含量為每公升3.7g時，細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10% CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5g時，則應(yīng)使用5%CO2培養(yǎng)細胞。

8、在培養(yǎng)基中加入 HEPES 有何好處?

培養(yǎng)基中最常用的緩沖體系是碳酸氫鹽，它可提供營養(yǎng)，但卻在生理 pH 條件下會降低緩沖能力。而HEPES 是一種很強的緩沖劑，能使細胞培養(yǎng)基在 pH7.2-7.6 條件下緩沖能力增強。

HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細胞時培養(yǎng)基脫離了 5%CO2 的環(huán)境，CO2 氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持 pH7.0 左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES。神經(jīng)細胞原代培養(yǎng)的過程中能用到。

9、NaHCO3的作用

培養(yǎng)基中使用了 NaHCO3-CO2 緩沖系統(tǒng)，并采用開放培養(yǎng)，使細胞代謝產(chǎn)生的CO2及時溢出培養(yǎng)瓶，再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2濃度（5%） ，與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值。

10、NEAA：非必須氨基酸

NEAA（非必需氨基酸） 是含幾種非必需氨基酸的合劑，添加到的原培養(yǎng)基不同，NEAA 也有不同的種類，比如添加至MEM的NEAA，含L-Alanine、L-Asparagine、L-Aspartic Acid、 L-Glutamic Acid、L-Glycine、L-Proline、L-Serine。

11、氯化鈣

氯化鈣對成骨細胞培養(yǎng)有毒性，所以成骨細胞的培養(yǎng)基中應(yīng)不含氯化鈣。

12、什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養(yǎng)基中用作pH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。酚紅本身對生物制品質(zhì)量并不會產(chǎn)生影響，可以通過純化技術(shù)去除，但酚紅在無血清培養(yǎng)基可能帶來胞內(nèi)鈉/鉀失衡，影響細胞生長，當(dāng)然這種作用能被血清所中和或減輕。酚紅并不是培養(yǎng)基中必需的一種成分，很多國外的疫苗或抗體生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中都使用無酚紅培養(yǎng)基。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

13、bFGF 和 EGF

bFGF是一個肝素結(jié)合的多膚類絲裂源，廣泛分布于各種組織中。bFGF 是一種重要的細胞增殖分化調(diào)節(jié)劑，可刺激多種細胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)它對滋養(yǎng)細胞也有促增殖作用。bFGF 主要是與細胞膜上FGF受體結(jié)合發(fā)揮作用，刺激與增殖有關(guān)的基因表達。Thomson 等認為，像其他體外培養(yǎng)的人體細胞一樣，hES 細胞要求 bFGF 的存在以促進增殖。同理EGF（上皮生長因子） , 是人體內(nèi)的一種活性物質(zhì)，由53個氨基組成的活細胞，藉由刺激表皮細胞生長因子受體之酪氨酸磷酸化，達到修補增生肌膚表層細胞，據(jù)說對受傷、受損之表皮肌膚擁有絕佳之療效，其最大特點是能夠促進細胞的增殖分化。所以加入它們都是促進細胞增殖的。

14、胰島素

胰島素（Insulin）作用廣泛，包括調(diào)節(jié)脂肪和蛋白質(zhì)的代謝以及促進細胞生長等。胰島素功能的發(fā)揮源于其對細胞的作用，進而引起組織乃至機體的整體反應(yīng)。一般可將胰島素在細胞水平的作用分為三大類：代謝作用、促生長作用、以及代謝和促生長混合作用。胰島素對細胞的代謝調(diào)節(jié)作用主要是通過其與細胞膜上的胰島素受體（Insulin receptor, IR）相互作用而介導(dǎo)，而胰島素對細胞的促生長作用則是通過其與細胞膜上胰島素樣生長因子受體（IGF Receptor, IG）相互作用而介導(dǎo)的。在無血清細胞培養(yǎng)液中，常添加胰島素來維持細胞生長，調(diào)節(jié)細胞對葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的攝取、利用和貯存，同時抑制糖原、蛋白質(zhì)和脂肪的分解。

15、無維生素 A 型 B-27 ® 添加劑

是定制的 B-27®添加劑，不含維生素A。維生素A（視黃醇） (能被轉(zhuǎn)化成視黃酸，后者可以誘導(dǎo)干細胞向神經(jīng)細胞的分化。不含維生素A的配方是干細胞培養(yǎng)的理想選擇。添加劑是50x的液體，可以與 Neurobasal®培養(yǎng)基或 Neurobasal®-A 培養(yǎng)基組合使用，用于神經(jīng)細胞培養(yǎng)而不需要再添加飼養(yǎng)層細胞。

16、雙抗和三抗

保持細胞生長良好狀態(tài)的法寶當(dāng)屬抗生素，適量濃度的的抗生素可有效防止微生物的污染。青霉素-鏈霉素混合溶液(100× 雙抗)(Penicillin-Streptomycin Solution, 100×)是專門用于細胞培養(yǎng)的雙抗，抗菌譜：革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液(100× 三抗)(Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution, 100×)也是可用于細胞培，抗菌譜：細菌、真菌和酵母。細胞培養(yǎng)需要了解不同細胞生長特性，還需要及時補充各類營養(yǎng)物質(zhì)以保持細胞良好的狀態(tài)。

培養(yǎng)基既是培養(yǎng)細胞中供給細胞營養(yǎng)和促使細胞生殖增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。細胞培養(yǎng)基作為細胞生長的物質(zhì)基礎(chǔ)，被廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)科和醫(yī)學(xué)研究等生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的各個領(lǐng)域。

來源：IMMOCELL 公眾號
說明：轉(zhuǎn)載只為分享目的，如有侵權(quán)請聯(lián)系刪除，謝謝！