細(xì)胞培養(yǎng)基中常見添加劑介紹
發(fā)布時(shí)間：2023-03-01 瀏覽次數(shù)：455
細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞培養(yǎng)基是不可或缺的，細(xì)胞培養(yǎng)基既是培養(yǎng)細(xì)胞中供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促使細(xì)胞生殖增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。
通常細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)需要加入血清，以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。而除了血清之外，部分細(xì)胞在培養(yǎng)過程中需要添加胰島素和β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）等成分來維持細(xì)胞狀態(tài)。MCF-7和NIH:OVCAR-3等細(xì)胞需要額外添加胰島素，而Thp-1和MC3T3-E1 subclone 14等細(xì)胞則需要添加β-巰基乙醇，不同細(xì)胞加入量會(huì)有差異，需根據(jù)細(xì)胞類型判斷。
同一種培養(yǎng)基也會(huì)因其添加物的不同而應(yīng)用于不同的細(xì)胞培養(yǎng)和不同的實(shí)驗(yàn)需求，下面就詳細(xì)介紹下細(xì)胞培養(yǎng)基中各種添加劑的功能。
添加劑介紹
1、L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？
L-谷氨酰胺（L-Glutamine）是細(xì)胞生長(zhǎng)的必須氨基酸，可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源，參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中狀態(tài)不穩(wěn)定，它的降解速率隨保存時(shí)間，保存溫度及保存環(huán)境pH值等變化而變化。L-丙胺酰-谷氨酰胺（L-alanyl-L-glutamine）是細(xì)胞培養(yǎng)中廣泛使用的L-谷氨酰胺的替代品，其在水溶液中穩(wěn)定性高，即可保持長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)供給，也降低了分解產(chǎn)物造成的細(xì)胞毒性。L-丙胺酰-谷氨酰胺溶液（L-alanyl-L-glutamine slution）可作為哺乳動(dòng)物貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞培養(yǎng)添加劑。與谷氨酰胺相比，L-丙胺酰-谷氨酰胺不會(huì)自行降解成氨而導(dǎo)致細(xì)胞毒性，作為添加物培養(yǎng)條件更加可控，可有效提高細(xì)胞活力。
2、培養(yǎng)基中谷氨酰胺作用及使用方法？
幾乎所有的細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺有較高的要求，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成蛋白質(zhì)，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡。所以，各種培養(yǎng)液中都含有較大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置-20℃ 冰凍保存，用前加入培養(yǎng)基中。加有谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基 4℃冰箱儲(chǔ)存兩周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺。
3、GlutaMAX-I是什么?培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？
GlutaMAX-I 即谷丙氨酸二肽，是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的 alpha-氨基用L-丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。
4、培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？
細(xì)胞通常以葡萄糖作為碳源，丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源。如果沒有足夠的葡萄糖供應(yīng)，細(xì)胞就會(huì)選擇丙酮酸鈉作為代謝底物。丙酮酸是糖酵解途徑中一個(gè)中間產(chǎn)物，也是 EM（Embden Myerhoff）途徑的第一步，所以培養(yǎng)基中添加的丙酮酸既可以作為能量的來源也可以為細(xì)胞的代謝提供碳骨架。對(duì)于某些特殊的細(xì)胞，丙酮酸對(duì)維持細(xì)胞的生存是必需的，丙酮酸對(duì)于某些細(xì)胞的繁殖和低血清濃度的增殖也是必不可少。培養(yǎng)基中的丙酮酸鈉濃度一般是 0.1 mM，商品化的丙酮酸鈉一般是 10mM（100X） 的溶液。
丙酮酸鈉（Sodium Pyruvate）是最常見的丙酮酸鹽，是一類內(nèi)源性小分子物質(zhì)，丙酮酸鈉和丙酮酸均是天然存在于人體內(nèi)，并參與全身各組織和器官的代謝。丙酮酸鈉在醫(yī)學(xué)上、診斷試劑以及醫(yī)療器械中被廣泛用作緩沖劑、賦形劑和抗氧化劑。在人體中行動(dòng)中大多數(shù)細(xì)胞只利用葡萄糖作為能量的物質(zhì)就夠了，而在細(xì)胞培養(yǎng)中丙酮酸鈉是必須的物質(zhì)。丙酮酸鈉在培養(yǎng)基中起到替代碳源的作用，參與細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)代謝。
5、Hank′s 平衡鹽溶液和 Earle′s 平衡鹽溶液有什么本質(zhì)功能差別？
HBS 和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在 Eagle′s（2.2g/L） 中比在 Hanks′（0.35g/L）中高。碳酸氫鈉需用高水平的 CO2 平衡，以維持溶液的 PH 值。Eagle′s 液在空氣水平的CO2中，溶液會(huì)變堿，Hanks′液在 CO2 培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagle′s液，如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks′液就可以了。
6、培養(yǎng)液pH對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響？
由于大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2-7.4，偏離此范圍可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但各種細(xì)胞對(duì)pH的要求也不完全相同，原代培養(yǎng)細(xì)胞一般對(duì)pH變動(dòng)耐受差，無限細(xì)胞系耐受力強(qiáng)。但總體來說，細(xì)胞耐酸性比耐堿性強(qiáng)一些。在配制培養(yǎng)用液時(shí)，需要注意一點(diǎn)：新配的培養(yǎng)基在經(jīng)過 0.10um 或 0.22um 濾膜過濾時(shí)，溶液的pH 還會(huì)向上浮動(dòng)0.2左右。
7、培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5%還是10%CO2，或者根本沒有影響？
一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3含量為每公升3.7g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10% CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5g時(shí)，則應(yīng)使用5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞。
8、在培養(yǎng)基中加入 HEPES 有何好處?
培養(yǎng)基中最常用的緩沖體系是碳酸氫鹽，它可提供營(yíng)養(yǎng)，但卻在生理 pH 條件下會(huì)降低緩沖能力。而HEPES 是一種很強(qiáng)的緩沖劑，能使細(xì)胞培養(yǎng)基在 pH7.2-7.6 條件下緩沖能力增強(qiáng)。
HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了 5%CO2 的環(huán)境，CO2 氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持 pH7.0 左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES。神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)的過程中能用到。
9、NaHCO3的作用
培養(yǎng)基中使用了 NaHCO3-CO2 緩沖系統(tǒng)，并采用開放培養(yǎng)，使細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2及時(shí)溢出培養(yǎng)瓶，再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2濃度（5%） ，與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值。
10、NEAA：非必須氨基酸
NEAA（非必需氨基酸） 是含幾種非必需氨基酸的合劑，添加到的原培養(yǎng)基不同，NEAA 也有不同的種類，比如添加至MEM的NEAA，含L-Alanine、L-Asparagine、L-Aspartic Acid、 L-Glutamic Acid、L-Glycine、L-Proline、L-Serine。
11、氯化鈣
氯化鈣對(duì)成骨細(xì)胞培養(yǎng)有毒性，所以成骨細(xì)胞的培養(yǎng)基中應(yīng)不含氯化鈣。
12、什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養(yǎng)基中用作pH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。酚紅本身對(duì)生物制品質(zhì)量并不會(huì)產(chǎn)生影響，可以通過純化技術(shù)去除，但酚紅在無血清培養(yǎng)基可能帶來胞內(nèi)鈉/鉀失衡，影響細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)然這種作用能被血清所中和或減輕。酚紅并不是培養(yǎng)基中必需的一種成分，很多國(guó)外的疫苗或抗體生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中都使用無酚紅培養(yǎng)基。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
13、bFGF 和 EGF
bFGF是一個(gè)肝素結(jié)合的多膚類絲裂源，廣泛分布于各種組織中。bFGF 是一種重要的細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)劑，可刺激多種細(xì)胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)它對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞也有促增殖作用。bFGF 主要是與細(xì)胞膜上FGF受體結(jié)合發(fā)揮作用，刺激與增殖有關(guān)的基因表達(dá)。Thomson 等認(rèn)為，像其他體外培養(yǎng)的人體細(xì)胞一樣，hES 細(xì)胞要求 bFGF 的存在以促進(jìn)增殖。同理EGF（上皮生長(zhǎng)因子） , 是人體內(nèi)的一種活性物質(zhì)，由53個(gè)氨基組成的活細(xì)胞，藉由刺激表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體之酪氨酸磷酸化，達(dá)到修補(bǔ)增生肌膚表層細(xì)胞，據(jù)說對(duì)受傷、受損之表皮肌膚擁有絕佳之療效，其最大特點(diǎn)是能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化。所以加入它們都是促進(jìn)細(xì)胞增殖的。
14、胰島素
胰島素（Insulin）作用廣泛，包括調(diào)節(jié)脂肪和蛋白質(zhì)的代謝以及促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)等。胰島素功能的發(fā)揮源于其對(duì)細(xì)胞的作用，進(jìn)而引起組織乃至機(jī)體的整體反應(yīng)。一般可將胰島素在細(xì)胞水平的作用分為三大類：代謝作用、促生長(zhǎng)作用、以及代謝和促生長(zhǎng)混合作用。胰島素對(duì)細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)作用主要是通過其與細(xì)胞膜上的胰島素受體（Insulin receptor, IR）相互作用而介導(dǎo)，而胰島素對(duì)細(xì)胞的促生長(zhǎng)作用則是通過其與細(xì)胞膜上胰島素樣生長(zhǎng)因子受體（IGF Receptor, IG）相互作用而介導(dǎo)的。在無血清細(xì)胞培養(yǎng)液中，常添加胰島素來維持細(xì)胞生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的攝取、利用和貯存，同時(shí)抑制糖原、蛋白質(zhì)和脂肪的分解。
15、無維生素 A 型 B-27 ® 添加劑
是定制的 B-27®添加劑，不含維生素A。維生素A（視黃醇） (能被轉(zhuǎn)化成視黃酸，后者可以誘導(dǎo)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化。不含維生素A的配方是干細(xì)胞培養(yǎng)的理想選擇。添加劑是50x的液體，可以與 Neurobasal®培養(yǎng)基或 Neurobasal®-A 培養(yǎng)基組合使用，用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)而不需要再添加飼養(yǎng)層細(xì)胞。
16、雙抗和三抗
保持細(xì)胞生長(zhǎng)良好狀態(tài)的法寶當(dāng)屬抗生素，適量濃度的的抗生素可有效防止微生物的污染。青霉素-鏈霉素混合溶液(100× 雙抗)(Penicillin-Streptomycin Solution, 100×)是專門用于細(xì)胞培養(yǎng)的雙抗，抗菌譜：革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液(100× 三抗)(Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution, 100×)也是可用于細(xì)胞培，抗菌譜：細(xì)菌、真菌和酵母。細(xì)胞培養(yǎng)需要了解不同細(xì)胞生長(zhǎng)特性，還需要及時(shí)補(bǔ)充各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以保持細(xì)胞良好的狀態(tài)。
培養(yǎng)基既是培養(yǎng)細(xì)胞中供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促使細(xì)胞生殖增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。細(xì)胞培養(yǎng)基作為細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)科和醫(yī)學(xué)研究等生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的各個(gè)領(lǐng)域。
來源：IMMOCELL 公眾號(hào)
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