導(dǎo)，我悟了，一直以來(lái)鋪板不均勻原來(lái)是因?yàn)樗?/h2>
發(fā)布時(shí)間：2025-05-29 瀏覽次數(shù)：137
在細(xì)胞培養(yǎng)的科研探索之路上，“鋪板為何總不均勻？”“消化傳代錯(cuò)用培養(yǎng)基該怎么辦？”“緩沖液中酚紅、鈣鎂離子對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)影響幾何？”
這些問(wèn)題如同攔路虎，頻頻困擾著實(shí)驗(yàn)人員。這些正是從細(xì)胞培養(yǎng)答疑群中精選出的三大熱點(diǎn)疑問(wèn)，我們將深入剖析，為你揭開細(xì)胞培養(yǎng)難題的神秘面紗。
1、鋪板不均勻
Q：鋪板次日，細(xì)胞分布疏密不均，部分區(qū)域密度極高，而有的地方卻稀疏得很，這究竟是怎么回事？
A：遇到細(xì)胞鋪板后分布不均的狀況，需要抽絲剝繭、分類分析。常見的不均勻類型主要有三種：隨機(jī)分布不均、邊緣多中間少、邊緣少中間多。
先來(lái)看第一種 —— 隨機(jī)分布的不均勻。這種情況的 “罪魁禍?zhǔn)住?，大概率是鋪板前?xì)胞未能充分分散為單細(xì)胞懸液。一旦存在細(xì)胞團(tuán)塊被接種到孔內(nèi)，經(jīng)過(guò)一夜生長(zhǎng)，這些區(qū)域自然就會(huì)呈現(xiàn)出細(xì)胞過(guò)密的現(xiàn)象。
想要規(guī)避此類問(wèn)題，可以從以下三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化：
1. 精準(zhǔn)把控細(xì)胞消化：部分細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶極為敏感，消化時(shí)極易成片脫落。針對(duì)這類細(xì)胞，應(yīng)避免使用含 EDTA 的胰蛋白酶；也可通過(guò)稀釋胰酶濃度，或者加入胰酶后迅速吸走大部分，僅留少量在瓶?jī)?nèi)消化，以此精準(zhǔn)調(diào)控消化進(jìn)程 。
2. 徹底吹散細(xì)胞：離心后的細(xì)胞重懸過(guò)程中，務(wù)必耐心細(xì)致地吹打，建議不少于 20 次。在細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，若發(fā)現(xiàn)仍有較多細(xì)胞團(tuán)，必須繼續(xù)吹打直至細(xì)胞充分分散。
3. 及時(shí)鏡檢篩選：完成鋪板后，需即刻在顯微鏡下隨機(jī)選取多個(gè)視野觀察。一旦發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞團(tuán)，該孔細(xì)胞應(yīng)果斷舍棄，重新鋪板；若多個(gè)孔均存在此問(wèn)題，則需更換新板重新操作。
第二種情況是邊緣多中間少，這種現(xiàn)象在孔面積較小的 96 孔板鋪板后尤為常見。
當(dāng)孔的面積特別小、例如96孔板這種，鋪板后就常見細(xì)胞邊緣多中間少的現(xiàn)象。究其原因，主要是孔內(nèi)液面形成了邊緣高、中間低的彎液面，導(dǎo)致表面張力分布不均。如下圖所示：
圖源：https://www.researchgate.net/figure/a-c-Solutions-of-the-three-dimensional-model-obtained-at-systematically-varied_fig3_350402772
此時(shí)，細(xì)胞在重力沉降的同時(shí)，還會(huì)受液體向孔邊緣流動(dòng)的拽力影響，逐漸聚集到邊緣區(qū)域。
而造成這種結(jié)果的操作因素主要有兩點(diǎn)：一是孔內(nèi)液體體積不足，二是液體打出速度過(guò)快。
以 96 孔板為例，當(dāng)孔內(nèi)液體體積小于 100μL 時(shí)，彎液面現(xiàn)象顯著；而增加到 200μL 時(shí)，細(xì)胞分布不均的情況會(huì)得到極大改善。
圖源：https://www.bmglabtech.com/en/howto-notes/how-to-deal-with-path-length-and-meniscus-in-microplates/
此外，若使用移液器快速將細(xì)胞懸液全部沖擊到孔內(nèi)壁，會(huì)在局部形成高液面，加劇細(xì)胞邊緣聚集；
相反，以 50μL / 秒的速度緩慢將液體沿孔壁注入，可促使孔底液面均勻鋪展，有效降低彎液面的影響。
對(duì)于 24 孔板、6 孔板等較大孔板，雖然彎液面效應(yīng)相對(duì)較弱，但同樣要保證足夠的液體體積，24 孔板建議加入 1mL 液體，6 孔板則需 3mL。
第三種邊緣少中間多的情況，多發(fā)生在 6 孔板等培養(yǎng)面積較大的孔板上。
這主要是由于細(xì)胞懸液持續(xù)沖向孔底部與孔壁連接處的邊緣，就像水管對(duì)著墻角噴水，水流會(huì)反向涌動(dòng)，使得細(xì)胞向打出方向的反方向流動(dòng)。
由于孔內(nèi)面積較大，細(xì)胞無(wú)法直接到達(dá)另一端，最終大量聚集在中部區(qū)域。
改善方法與上述類似，可降低液體打出速度，讓細(xì)胞懸液沿孔壁緩緩流入，并增加液體打出的位置，選擇 2 - 3 個(gè)孔內(nèi)壁位置分次注入全部液體。
以上就是細(xì)胞鋪板不均勻的三種情況的對(duì)應(yīng)原因分析和解決辦法。不少同學(xué)還關(guān)心鋪板后的混勻操作，即如何搖晃孔板？
在這方面，關(guān)鍵在于把握搖晃力度與靜置時(shí)長(zhǎng)。
對(duì)于 96 孔板，可在臺(tái)面上輕柔地畫 “十” 字或 “∞” 字，重復(fù) 2 - 3 輪；
而 24 孔板、6 孔板，因孔內(nèi)液體多、開口面積大，大幅度晃動(dòng)易導(dǎo)致液體灑出，建議一手扶住孔板一側(cè)，另一手輕輕拍打?qū)?cè)邊緣 5 - 6 次。
無(wú)論何種規(guī)格的孔板，搖晃后都需靜置臺(tái)面至少 15 分鐘。然后再輕輕拿起來(lái)、慢慢走到培養(yǎng)箱旁放下，打開培養(yǎng)箱的門后，輕輕拿起培養(yǎng)板、小心放入，再輕輕關(guān)上門。
因?yàn)槲覀円尲?xì)胞有足夠的時(shí)間沉到孔底，所以靜置的時(shí)間要足夠，不用擔(dān)心細(xì)胞在外面晾著會(huì)不會(huì)有問(wèn)題，不會(huì)。我們拿起來(lái)孔板走動(dòng)、放置這些動(dòng)作都會(huì)造成液面波動(dòng)，因此如果靜置時(shí)間不夠，細(xì)胞就會(huì)被液體流動(dòng)帶偏了。
2、用錯(cuò)培養(yǎng)基
Q：我的細(xì)胞一直用 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，消化后不慎使用 1640 培養(yǎng)基進(jìn)行重懸和培養(yǎng)，這會(huì)對(duì)細(xì)胞有影響嗎？
A：對(duì)于這種臨時(shí)用錯(cuò)培養(yǎng)基的情況，需要依據(jù)發(fā)現(xiàn)時(shí)間來(lái)分類處理：若在幾小時(shí)內(nèi)察覺錯(cuò)誤，還有補(bǔ)救機(jī)會(huì)；若 2 - 3 天后才發(fā)現(xiàn)，則需根據(jù)細(xì)胞類型和狀態(tài)做進(jìn)一步判斷。
市面上常見的 1640、DMEM、F12 等商品培養(yǎng)基，都是在 MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方上改良而來(lái)，其差異主要體現(xiàn)在對(duì)不同細(xì)胞生長(zhǎng)的適配性，而非細(xì)胞毒性或損傷。
圖源：https://www.researchgate.net/figure/Composition-of-different-cell-culture-media-and-Krebs-Henseleit-buffer_tbl3_232224965
若在幾小時(shí)內(nèi)發(fā)現(xiàn)用錯(cuò)培養(yǎng)基，可將細(xì)胞懸液吸出，通過(guò)離心去除錯(cuò)誤培養(yǎng)基，重新更換正確培養(yǎng)基即可。
若是 2 - 3 天后或次日才發(fā)現(xiàn)，此時(shí)貼壁細(xì)胞大概率已完成貼壁，你可以根據(jù)細(xì)胞的類型、狀態(tài)來(lái)判斷下一步操作。
原代細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基成分較為敏感，錯(cuò)用培養(yǎng)基可能導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差，出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯甚至少量死亡，遇到這種情況建議直接棄用；而細(xì)胞系通常耐受性較強(qiáng)，一般不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，無(wú)需消化細(xì)胞，直接更換為正確培養(yǎng)基即可。
3、鈣鎂/酚紅
Q：在選擇 HBSS 緩沖液時(shí)，面對(duì)含鈣鎂離子 / 不含鈣鎂離子、含酚紅 / 不含酚紅等不同規(guī)格，該如何抉擇？
A：選擇 HBSS 緩沖液的關(guān)鍵在于匹配實(shí)驗(yàn)需求，我們從離子成分和酚紅添加兩方面拆解分析。
一、Ca2?/Mg2?對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響與選擇
Ca2?和 Mg2?是細(xì)胞生理活動(dòng)的 “幕后功臣”：Ca2?如同細(xì)胞與膠原、纖連蛋白等外基質(zhì)間的 “黏合劑”，能顯著提升細(xì)胞貼壁能力；Mg2?則作為 ATP 酶、DNA 聚合酶等核心酶的 “助手”，深度參與細(xì)胞代謝與信號(hào)傳導(dǎo)。
若需消化細(xì)胞：建議優(yōu)先使用不含鈣鎂離子的 HBSS。這是因?yàn)橐鹊鞍酌傅幕钚詴?huì)受鈣鎂離子濃度抑制 —— 想象胰酶是把 “剪刀”，而鈣鎂離子像無(wú)形的手束縛住它，導(dǎo)致剪碎細(xì)胞間連接的效率降低。此時(shí)用無(wú)鈣鎂 HBSS 洗滌，能為消化 “掃清障礙”。
若細(xì)胞貼壁不佳：可嘗試用含鈣鎂離子的 HBSS洗滌細(xì)胞。通過(guò)補(bǔ)充關(guān)鍵離子，增強(qiáng)細(xì)胞與基質(zhì)的黏附力，就像給細(xì)胞貼上更牢固的 “雙面膠”，改善貼壁狀態(tài)。
二、酚紅的作用與使用場(chǎng)景
酚紅是細(xì)胞培養(yǎng)中的 “pH 偵察兵”：當(dāng)環(huán)境 pH 為 7.4 時(shí)，它呈現(xiàn)標(biāo)志性紅色；pH 下降（如細(xì)菌污染導(dǎo)致代謝酸積累），溶液迅速變黃；pH 上升則轉(zhuǎn)為紫色。這一特性使其成為判斷細(xì)胞狀態(tài)的 “可視化工具”。
圖源：https://www.researchgate.net/figure/Monitoring-pH-changes-in-cell-culture-by-phenol-red-Phenol-red-Phenolsulfonphthalein_fig1_368733721
如果細(xì)胞受到細(xì)菌污染，培養(yǎng)基就會(huì)很快變黃，其主要原因就是培養(yǎng)環(huán)境的pH下降得很多，造成酚紅變色了。因此，培養(yǎng)基的酚紅可以輔助我們判斷一些細(xì)胞狀態(tài)。
熒光或流式實(shí)驗(yàn)：必須選用不含酚紅的 HBSS。酚紅的自發(fā)熒光如同 “干擾信號(hào)”，會(huì)掩蓋實(shí)驗(yàn)觀察的真實(shí)熒光信號(hào)或影響流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)精度。實(shí)驗(yàn)前需用無(wú)酚紅緩沖液徹底洗滌細(xì)胞，確保結(jié)果不受干擾。
最后再補(bǔ)充一個(gè)知識(shí)點(diǎn)，就是胰蛋白酶是否含EDTA對(duì)細(xì)胞消化有什么影響呢？
EDTA通過(guò)結(jié)合Ca2?/Mg2?，破壞細(xì)胞間連接（如鈣黏蛋白依賴的細(xì)胞連接），輔助胰酶消化，當(dāng)面對(duì)一些難以消化的細(xì)胞時(shí)，可以嘗試使用含EDTA的胰蛋白酶。
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