中國工程院食品安全院士團(tuán)隊(duì)

科研成果轉(zhuǎn)化平臺

1.預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/strong>確定慢病毒對細(xì)胞的感染MOI和最佳的感染條件，為正式實(shí)驗(yàn)提供參考，如感染試劑的選擇，感染時(shí)的總體積感染后換液的時(shí)間等。

2.預(yù)實(shí)驗(yàn)分組：按照不同培養(yǎng)條件將實(shí)驗(yàn)分為4組。分別為：

Ⅰ、Control組(C組)：監(jiān)控實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞生長是否正常（加入完全培養(yǎng)基，不含病毒和助轉(zhuǎn)染試劑）
Ⅱ、接毒組(M組)：觀察常規(guī)培養(yǎng)條件下病毒對細(xì)胞的感染效果（首先用陰性對照（NC）病毒來摸條件，加入一定量的完全培養(yǎng)基和病毒液）
Ⅲ、病毒液+HiTransG A（助轉(zhuǎn)染試劑）組(A組)：觀察HiTransG A是否可以提升感染效果（完全培養(yǎng)基+HiTransG A+NC病毒液）
Ⅳ、病毒液+HiTransG P（助轉(zhuǎn)染試劑）組(P組)：觀察HiTransG P是否可以提升感染效果（完全培養(yǎng)基+HiTransG P+NC病毒液）

3.預(yù)實(shí)驗(yàn)操作方案

3.1.貼壁細(xì)胞

Day1:接種細(xì)胞：用完全培養(yǎng)基制備3ml密度為3~5×10⁴個(gè)/ml細(xì)胞懸液。具體細(xì)胞密度可根據(jù)實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞生長情況及大小進(jìn)行調(diào)節(jié)，取100μl加入96孔板中，共16個(gè)孔，其中3個(gè)孔作為Control組，37°C 培養(yǎng)16-24h，至細(xì)胞匯合度為20-30%（也可直接鋪板時(shí)時(shí)直接鋪20-30%的細(xì)胞,，貼壁較快的細(xì)胞等待4-6h及可進(jìn)行接毒）對于大部分細(xì)胞，我們通常認(rèn)為培養(yǎng)24h后細(xì)胞數(shù)量是鋪板時(shí)數(shù)量的兩倍,每孔細(xì)胞數(shù)量約1W。

Day2：感染

Ⅰ、從冰箱取出病毒，冰上融化。用完全培養(yǎng)基依次將病毒稀釋至滴度1x10^8 TU/ml， 5x10^7TU/ml， 2.5x10^7TU/ml, 1x10^7TU/ml，稀釋完成后每組最少35μl。
Ⅱ、吸掉各孔中上清液，按照表1更換培養(yǎng)基， 加入病毒及相應(yīng)感染增強(qiáng)液， 混勻，繼續(xù)培養(yǎng)。感染后16-24h用完全培養(yǎng)基進(jìn)行換液，過程中觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)生變化時(shí)可以提前到8h換液， 保持細(xì)胞正常生長。

表1.預(yù)實(shí)驗(yàn)分組及感染

Day3-4：繼續(xù)培養(yǎng)：中途可根據(jù)細(xì)胞的生長狀況進(jìn)行換液，保持細(xì)胞活性。

Day5：感染效果確認(rèn)：感染約72-96h，熒光表達(dá)豐度較高時(shí)，用顯微鏡觀察。感染效率80%左右，且細(xì)胞生長良好的組所對應(yīng)的感染條件和MOI即可以作為后續(xù)感染實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。

3.2.懸浮細(xì)胞

相對于貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞在第一天即可完成接種和感染操作，且接種細(xì)胞數(shù)量需在1W左右 cells/孔，接種時(shí)同時(shí)感染病毒，感染8-24h，根據(jù)細(xì)胞生長情況進(jìn)行加液操作，無需換液，以免損失細(xì)胞。其余操作同貼壁細(xì)胞。

3.3.半懸半貼細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)方案：略。建議參考懸浮細(xì)胞操作方案進(jìn)行。

注解：

MOI: 復(fù)感染指數(shù)，是指病毒對細(xì)胞的感染能力，MOI越高，細(xì)胞越難被感染。通常把某株細(xì)胞有80%被感染時(shí)所用的病毒顆粒數(shù)和細(xì)胞數(shù)目的比值作為該株細(xì)胞的MOI。
MOI=（病毒滴度 × 病毒體積） / 細(xì)胞數(shù)目

HitransG A ：吉?jiǎng)P基因自主研發(fā)的病毒感染增強(qiáng)液。它的主要成分是一種新型的高分子非離子表面活性劑，同時(shí)也是一種細(xì)胞保護(hù)劑和促進(jìn)吸收劑。它可以通過提高細(xì)胞表面活性，增加病毒與細(xì)胞的接觸面積，促進(jìn)病毒高效感染細(xì)胞，且對細(xì)胞毒性極低，適合敏感細(xì)胞使用。
HitransG P：吉?jiǎng)P基因自主研發(fā)的病毒感染增強(qiáng)液。它的主要成分是一種陽離子聚合物，通過抑制細(xì)胞膜與病毒之間的電荷排斥， 增加慢病毒對細(xì)胞的感染效率。本產(chǎn)品可以極大提高細(xì)胞感染效率，且細(xì)胞毒性顯著低于Polybrene。

參考資料：GE042.6重組慢病毒載體使用手冊

文章來源：環(huán)凱轉(zhuǎn)載于“ 愛吃洋芋的酸菜魚”公眾號；原標(biāo)題：“細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn)方案分享”；作者~ GAPDH。
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