中國工程院食品安全院士團隊

科研成果轉(zhuǎn)化平臺

快速鑒定病原菌是確保適當給藥以減輕抗生素耐藥性進展的關鍵先決條件?；瘜W鼻策略通過使用化學傳感陣列和機器學習算法模擬動物嗅覺，為物種識別和區(qū)分提供了一種潛在的方法。其中，熒光傳感器陣列因其高靈敏度而備受關注。而當前的大多數(shù)熒光傳感陣列策略依賴于探針和病原菌之間的非特異性相互作用。這些相互作用很容易被周圍環(huán)境的變化所破壞，導致它們在復雜基質(zhì)中的可行性大大降低。同時，這些方法難以應用于復雜的樣本矩陣和識別訓練集之外的未知物種。

代謝標記是一種不干擾其生理過程的情況下將化學基團納入生物體的有效方法。其中，外源性D-氨基酸在細菌特異性識別方面具有獨特的優(yōu)勢。通常，外源性D-氨基酸通過代謝過程整合，決定外源D-氨基酸標記的有三種酶，即D，D-轉(zhuǎn)肽酶，D，D-羧基肽酶，L，D-轉(zhuǎn)肽酶。外源性D-氨基酸可以通過D，D-轉(zhuǎn)肽酶或L，D-轉(zhuǎn)肽酶介導的代謝方式整合進細菌肽聚糖結(jié)構(gòu)。通過代謝途徑整合的D-氨基酸可能會被D，D-羧肽酶進一步水解，降低外源性D-氨基酸融入肽聚糖結(jié)構(gòu)的總體水平。其中D，D-轉(zhuǎn)肽酶和D，D-羧基肽酶存在于所有細菌中，但其類型和數(shù)量各不相同。而L，D-轉(zhuǎn)肽酶僅存在于有限種類的細菌中。這種差異導致不同菌種間外源D-氨基酸整合程度不同。由于這些酶的活性是動態(tài)變化的，與細菌的生長和分裂密切相關，因此這些酶介導的代謝標記可能在不同條件下表現(xiàn)出差異，為病原菌的鑒定提供了有價值的信息。

本研究基于肽聚糖代謝過程中酶活性動態(tài)變化，建立了一種用于區(qū)分病原菌的代謝標記化學鼻方法（圖1）。對數(shù)生長期的細菌在pH=5和7的條件下被3-疊氮基-D-丙氨酸（D-Ala-N₃）代謝標記。然后在不同時間點用二苯并環(huán)辛炔功能化的上轉(zhuǎn)換納米顆粒（DBCO-UCNPs）點擊以產(chǎn)生一系列熒光信號輸出。輸出的信號通過機器學習算法處理，以識別和區(qū)分病原菌。這種感知策略可以精確區(qū)分不同的菌株和物種。由于反應變化與病原菌的內(nèi)在特性，即代謝活性有關，因此，該策略對復雜基質(zhì)具有高耐受性，并能夠精確識別訓練集之外的物種。其可靠、準確的病原菌鑒定能力使其在臨床檢測和診斷中具有廣闊的應用前景。

圖1 化學鼻策略鑒別病原菌的示意圖。（A）D, D-TPase和L, D-TPase分別介導外源性D-Ala-N₃交換五肽鏈的第5和第4個D-氨基酸；D，D-羧基肽酶會水解五肽末端的D-氨基酸，包括外源的D-氨基酸。（B）在4種條件下，用D-Ala-N₃對病原菌進行代謝標記，然后通過點擊反應進行信號輸出。（C）借助機器學習識別病原菌的傳感器陣列。

研究首先通過熱解方法合成上轉(zhuǎn)換納米粒子，然后通過配體交換機理，使用二苯并環(huán)辛炔（DBCO）將上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNPs）功能化，形成DBCO-UCNPs納米顆粒。相比之下，DBCO-UCNPs具有更高的熒光強度，在980 nm激光激發(fā)下，觀察到521、541和654 nm處的熒光發(fā)射，這與未修飾的上轉(zhuǎn)換納米粒子相同。由于相對較高的靈敏度，選擇541 nm處收集熒光發(fā)射，用于后續(xù)檢測。

然后研究了傳感策略的可行性。在不同培養(yǎng)條件下不同代謝標記菌株在發(fā)生點擊后的熒光強度變化，確認是否可以作為識別元素用于多種病原菌的鑒別。并在不同培養(yǎng)條件下連續(xù)測定3天，評估策略的穩(wěn)定性。

圖2 傳感策略的可行性分析。（A）不同培養(yǎng)條件下代謝標記的金黃色葡萄球菌（ATCC25923（Sa））的熒光光譜。（B）不同模型菌株（金黃色葡萄球菌 ATCC 29213（SA）、金黃色葡萄球菌 ATCC 43300（MR）、大腸埃希氏菌O157:H7（EC）和大腸埃希氏菌ER2738）在pH=7條件下代謝標記60 min并與DBCO修飾的上轉(zhuǎn)換納米粒子發(fā)生點擊反應。（C）不同條件下代謝標記的ER與DBCO修飾的上轉(zhuǎn)換納米粒子點擊反應之后的歸一化熒光強度；（D）在條件B下連續(xù)測試3天內(nèi)策略的穩(wěn)定性。條件A：pH=5，代謝標記20 min；條件B：pH=7，代謝標記20 min；條件C：pH=5，代謝標記60 min；條件D：pH=7，代謝標記60 min。

接著以8種菌株（5株革蘭氏陽性菌和3株革蘭氏陰性菌，包括革蘭氏陽性和陰性抗生素敏感菌株和耐藥菌株）作為模型菌株進行檢測，評估該方法在訓練集內(nèi)的鑒別能力。

圖3 訓練集中8種細菌的鑒別。8種菌株的（A）熒光指紋圖譜；（B）熱圖；（C）聚類數(shù)突圖；（D）PCA聚類圖。

總之，本研究提供了一種基于肽聚糖代謝過程中酶活性動態(tài)變化的化學鼻策略，用于快速準確地識別病原菌。借助上轉(zhuǎn)換納米顆粒將不同代謝標記條件下細菌酶活性的變化轉(zhuǎn)化為熒光信號進行輸出，用于病原菌鑒定。所提出的策略在復雜的基質(zhì)中具有高耐受性，如尿液。此外，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌之間不同的代謝標記行為有助于根據(jù)革蘭氏特性鑒別病原菌。進一步將抗生素依賴傳感通道納入所建立的傳感策略有利于在抗生素藥敏測試中區(qū)分抗生素耐藥性。

論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116264

來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~馮燕梅