中國工程院食品安全院士團(tuán)隊(duì)

科研成果轉(zhuǎn)化平臺

快速靈敏地檢測病原菌對疾病預(yù)防和控制至關(guān)重要。具有 DNA 切割能力的 CRISPR/ Cas12a 系統(tǒng)有望用于病原菌診斷。然而，基于CRISPR的檢測方法的靈敏度不夠理想，且成本較高。在此背景下，Yanfei Qi團(tuán)隊(duì)發(fā)表在Analytica Chimica Acta上的文章《A programmable sensitive platform for pathogen detection based on CRISPR/Cas12a-hybridization chain reaction-poly T-Cu》報(bào)告了一種基于 CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)、雜交鏈反應(yīng)（HCR）和聚 T-銅熒光納米探針的多功能靈敏病原體檢測平臺（HTCas12a）。

為了提高檢測靈敏度，研究人員利用了雜交鏈反應(yīng)（HCR）。HCR是一種在級聯(lián)反應(yīng)中利用兩個(gè)發(fā)夾 DNA 的無酶擴(kuò)增過程，是一種多功能、高效的等溫?cái)U(kuò)增方法。在該平臺中，使用了HCR對低濃度核酸進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生的長鏈 DNA 含有可被 Cas12a/crRNA 復(fù)合物識別的 PAM 序列，從而啟動 CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)的順式和反式裂解活動。通過將 HCR 與 Cas12a 結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)信號的兩步放大，從而大大提高檢測的靈敏度。

基于 Cas12a 的核酸檢測中，常利用酶分子識別事件轉(zhuǎn)化為熒光報(bào)告探針信號的變化。報(bào)告探針一般由帶有熒光團(tuán)和淬滅劑的 ssDNA 構(gòu)建而成，需要進(jìn)行復(fù)雜的修飾，因此價(jià)格昂貴。為了解決這個(gè)問題，研究人員轉(zhuǎn)向了新的報(bào)告探針——聚胸腺嘧啶（T）模板銅納米粒子（polyT-Cu NPs）因其低成本、大斯特克斯位移和穩(wěn)定的光學(xué)特性，在生物分析領(lǐng)域引起了極大的研究興趣。研究人員將熒光聚 T-Cu NPs 集成到了 HCR-CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)中，當(dāng)CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的裂解啟動后，裂解剩余的聚 T40 作為模板與 Cu 離子快速反應(yīng)，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。整個(gè)實(shí)驗(yàn)成本低到每個(gè)樣品不到一美元。

為了進(jìn)一步拓寬 HTCRISPR-Cas12a 檢測的應(yīng)用范圍，研究人員選擇金黃色葡萄球菌作為 HTCRISPR-Cas12a 檢測的驗(yàn)證模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCR-CRISPR 檢測方法在 ssDNA 和金黃色葡萄球菌檢測方面具有優(yōu)異的分析性能，包括高靈敏度、單核苷酸特異性、無需分離且耗時(shí)短。值得一提的是，HTCas12a 檢測不需要任何儀器，是一種適用于床邊檢測（POCT）的模式。同時(shí)，發(fā)夾 DNA 可根據(jù)目標(biāo) DNA 的變化而改變，只需根據(jù)目標(biāo) DNA 的變化修改發(fā)夾鏈的堿基，即可實(shí)現(xiàn)脫氧核糖核酸的檢測。此外，熒光強(qiáng)度和目標(biāo)數(shù)量之間實(shí)現(xiàn)了良好的線性相關(guān)，目標(biāo) DNA 的檢測限低至23.36 μM，金黃色葡萄球菌的檢測限為 4.17 CFU/mL。

結(jié)論：本研究利用 CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)、HCR 和 Poly T40 銅簇共軛物設(shè)計(jì)了一種高靈敏度的病原體檢測平臺。與標(biāo)準(zhǔn)診斷方法相比，該平臺具有極高的靈敏度和特異性，準(zhǔn)確率也很高。該平臺具有三個(gè)顯著優(yōu)勢： 首先，它采用兩步信號放大法實(shí)現(xiàn)了靈敏的病原體檢測。其次，它可以通過 DNA 檢測和適配體直接檢測各種病原體。最后，檢測成本非常低，每個(gè)樣本不到一美元，如此低廉的成本為在貧困和偏遠(yuǎn)地區(qū)檢測病原體提供了可能。

本研究存在的不足：仍有必要進(jìn)一步提高該平臺的單堿基特異性；另外，該檢測方法在檢測雙鏈 DNA 目標(biāo)物方面需要預(yù)處理以產(chǎn)生單鏈DNA。

參考文獻(xiàn)：
1、Haolin Sun, Xiaoyu Zhang, Hainan Ma et al. A programmable sensitive platform for pathogen detection based on CRISPR/Cas12a -hybridization chain reaction-poly T-Cu, Analytica Chimica Acta, 1317, 2024, 342888.
2、DOI: 10.1016/j.aca.2024.342888

來源：微生物安全與健康網(wǎng)
鏈接：https://www.mbiosh.com/column/testing-technology/testing-technology-method/28399