免染SDS-PAGE膠，解鎖蛋白電泳新寶藏
發(fā)布時間：2023-09-27 瀏覽次數(shù)：303
1.免染SDS-PAGE膠原理和特點
免染SDS-PAGE膠使用的免染成像技術(shù)可實現(xiàn)電泳和轉(zhuǎn)印過程中諸多環(huán)節(jié)的蛋白條帶可視化，該技術(shù)使用獨特的三鹵化合物添加到凝膠中，該三鹵化合物與色氨酸殘基共價結(jié)合，僅需短時間的紫外光激活使變性蛋白質(zhì)直接在凝膠中發(fā)出熒光，實現(xiàn)蛋白的可視化，操作流程簡單，可檢測低至10—25 ng的蛋白質(zhì)。
該方法實現(xiàn)了蛋白質(zhì)在凝膠中的可視化，熒光基團與蛋白質(zhì)分子共價結(jié)合，直接可在轉(zhuǎn)印后的凝膠及膜上成像，無需額外的染色和脫色步驟，并在轉(zhuǎn)印后的膜上依然可見，不會干擾電泳或下游實驗步驟。
此外，免染成像可消除內(nèi)參蛋白作為蛋白質(zhì)印跡上樣對照的內(nèi)在問題，從而使用戶能夠通過將條帶對每個泳道中的總蛋白歸一化來獲得真正定量的蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)。
2.免染SDS-PAGE膠使用過程
圖1 免染SDS-PAGE膠使用過程
3.免染SDS-PAGE膠技術(shù)優(yōu)勢
免染凝膠獲得的蛋白質(zhì)可視化數(shù)據(jù)與其他染料染色的凝膠數(shù)據(jù)具有可比性。一般來說，免染凝膠的靈敏度與考馬斯亮藍染色相近（見圖2）。使用免染凝膠技術(shù)可以在電泳后立即可視化蛋白，同時做western-blot時可在抗體孵育前驗證目標(biāo)蛋白是否從凝膠轉(zhuǎn)印到膜上，而無需染色/脫色步驟，可節(jié)省時間2-4 h。
左：免染SDS-PAGE凝膠成像；右：普通考馬斯亮藍染色
泳道1：ATCC25922(大腸桿菌),
泳道2：FSCC215239（沙門氏菌）;
泳道3:ATCC27562（創(chuàng)傷弧菌）
泳道4:FSCC2150497（沙門氏菌）泳道5:ATCC33847（副溶血性弧菌）
圖2 免染凝膠成像與考馬斯亮藍染色對比圖
4.常見問題
問題1：我是否需要購買新的緩沖液和試劑才能使用免染技術(shù)？
回答：免染凝膠不使用專門的緩沖液或試劑。可以使用標(biāo)準(zhǔn)的SDS-PAGE緩沖液，但需要能夠激活染料并可視化的成像儀。
問題2：由于免染技術(shù)利用色氨酸殘基進行化學(xué)偶聯(lián)，是否影響我對總蛋白的檢測？
回答：從理論上講，即使只有一個色氨酸殘基也足以激活信號，并且可以輕松檢測和定量只有兩個色氨酸殘基的蛋白質(zhì)。對于大多數(shù)應(yīng)用，色氨酸殘基用于可視化的要求不是問題。UniProt數(shù)據(jù)顯示所有物種所含的蛋白質(zhì)中只有約10%缺乏色氨酸，且大多數(shù)蛋白質(zhì)的大小都小于10 kD。在大多數(shù)生物中，大約90%的蛋白質(zhì)大小超過10 kD（在10—260 kD 范圍內(nèi)）并具有色氨酸殘基（表 1）。
表1. 幾種模型生物的預(yù)測蛋白質(zhì)組的色氨酸含量
