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細(xì)胞狀態(tài)不好原因

細(xì)胞間的小伙伴們肯定遇到過細(xì)胞狀態(tài)很差，常常出現(xiàn)的現(xiàn)象是：細(xì)胞邊緣不清晰、細(xì)胞不飽滿、折光性差、背景比較臟、黑點(diǎn)很多、細(xì)胞碎片多（細(xì)胞凋亡后的細(xì)胞碎片）、單個細(xì)胞內(nèi)有空泡（凋亡）且空泡比較多；如果細(xì)胞出現(xiàn)老化，也就是細(xì)胞比較扁平、增殖減緩、細(xì)胞核體積增大、細(xì)胞突觸變多，此時觀察到的細(xì)胞狀態(tài)也是不正常的。因此細(xì)胞狀態(tài)差只是對這些現(xiàn)象的一種籠統(tǒng)說法。究其根本，細(xì)胞狀態(tài)變差主要是由于幾種原因：
● 細(xì)胞營養(yǎng)條件不夠或不適應(yīng)
● 細(xì)胞污染
● 細(xì)胞老化
● 細(xì)胞復(fù)蘇問題

細(xì)胞狀態(tài)不好原因分析

小編幫您深入分析影響細(xì)胞狀態(tài)的這些原因。

一、細(xì)胞營養(yǎng)條件不夠或不適應(yīng)

細(xì)胞營養(yǎng)條件不夠時，就需要從培養(yǎng)基方面考慮。

1. 胎牛血清
由于血清來源于動物，且含有細(xì)胞培養(yǎng)中所需的各種營養(yǎng)（血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機(jī)物等），這奠定了血清是細(xì)胞培養(yǎng)實驗中最-普遍的試劑的基礎(chǔ)。當(dāng)實驗需要更換血清時，細(xì)胞需要有一段適應(yīng)期。因此，要根據(jù)自己的細(xì)胞種類進(jìn)行合適的選擇。

2. 基礎(chǔ)培養(yǎng)基
培養(yǎng)細(xì)胞時，除了血清還需要添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基，混合成為完全培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基是成分確定且知其確切含量的，可以補(bǔ)充血清中缺乏的營養(yǎng)元素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基一般含有氨基酸、無機(jī)鹽、維生素、含碳物質(zhì)，蛋白和其他營養(yǎng)元素，每種成分對于細(xì)胞存活、代謝等功能都有不同影響，不同細(xì)胞系需要的成分含量也不同，因此市面上會存在各類培養(yǎng)基配方，如DMEM，RPMI-1640，M-199，MEM等，基礎(chǔ)培養(yǎng)基也需要根據(jù)自己培養(yǎng)的細(xì)胞種類進(jìn)行更合適的選擇。
自行配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基時，需要注意是否需另外添加營養(yǎng)物或必需物至培養(yǎng)基中（如：碳酸氫鈉）并調(diào)整pH值。使用不適合的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞仍可生長但特性會改變。培養(yǎng)基中常用的酚紅（pH指示劑）本身有微弱雌激素作用，會刺激具有雌激素受器的細(xì)胞生長。針對上述原因細(xì)胞不適應(yīng)我們建議以下解決方法：最好使用最適宜的培養(yǎng)基，如果條件不允許，可以換液時不要全量換液逐漸增加新的培養(yǎng)基比例，1/4、1/2、3/4到1，多傳代幾次，讓細(xì)胞慢慢適應(yīng)。另外，細(xì)胞培養(yǎng)箱的溫度、CO2、細(xì)胞的生存環(huán)境要適宜，一般來說最佳溫度：是37 ℃， CO2：濃度為5% ， pH：為7.2-7.4，還有滲透壓等，大家要注意調(diào)好，不要隨意改變。

二、細(xì)胞被污染了

污染情況通常從以下幾部分考慮。

通常微生物污染也叫做外源污染，如：真菌、酵母菌、細(xì)菌、支原體、黑膠蟲、病毒、細(xì)胞交叉污染等。

1. 真菌污染
這類微生物外觀類似棉絮狀的漂浮物，在顯微鏡下可觀察到菌絲體，污染早期不會使培養(yǎng)基變黃。

2. 酵母菌污染
顯微鏡下常見成串的珠狀物形態(tài)呈卵形，大約比細(xì)胞小5~10倍，當(dāng)其進(jìn)行出芽生-殖時，會聚集成連體結(jié)構(gòu)；爆發(fā)污染嚴(yán)重時，會造成培養(yǎng)基pH值改變，不易除去。

3. 細(xì)菌污染
培養(yǎng)基在短時間內(nèi)變成黃色或白色渾濁，細(xì)胞停止生長甚至死亡；有些狀況下培養(yǎng)基顏色改變不明顯但細(xì)胞形態(tài)會變異（出現(xiàn)多角，多核狀況）、細(xì)胞不附著，顯微鏡觀察背景有大量黑點(diǎn)。

4. 支原體污染
支原體種類較多，常以寄生或腐生營養(yǎng)方式生長，廣泛存在于環(huán)境之中，是細(xì)胞培養(yǎng)過程常見污染，經(jīng)常來源于實驗人員（支原體常見于人體皮膚、呼吸道、生-殖道和消化道）、動物源血清及胰酶、消毒不完全的器具，大小只有0.15~0.3μm，所以能通過一般標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)過濾方法，0.22μm過濾膜。支原體增長速度相較于細(xì)菌比較緩慢，污染初期（輕微）培養(yǎng)基可能依然清澈不會變黃，所以輕微污染時不容易用常規(guī)方法發(fā)現(xiàn)（細(xì)胞外觀觀察或是DNA染色法）確認(rèn)。支原體污染不但會緩慢改變細(xì)胞形態(tài)、增殖、基因表達(dá)、蛋白合成及代謝反應(yīng)，它攜帶的DNA/RNA與蛋白更可能造成QPCR、Western Blot或外泌體實驗結(jié)果偏差。

5. 黑膠蟲污染
目前科學(xué)界對黑膠蟲并無定論，認(rèn)為是不明沉淀現(xiàn)象或多種未知生物污染現(xiàn)象的通稱。在高倍率顯微鏡頭下，可觀察到各式形狀的小黑點(diǎn)（卵圓狀、球狀、桿狀等）、活躍的布朗運(yùn)動及明顯游動現(xiàn)象，部分黑膠蟲具有細(xì)胞毒性，可引起細(xì)胞生長遲緩或裂解凋亡。

6. 病毒污染
病毒感染可能來自宿主動物細(xì)胞或病人，病毒感染及傳播具有細(xì)胞專一性，在細(xì)胞培養(yǎng)污染物中是相對較難檢測的。然而一旦細(xì)胞遭受污染后顯微鏡下能明顯觀察到細(xì)胞碎片增多、腫大、圓縮、脫落等病態(tài)變形，嚴(yán)重時會在單層細(xì)胞上觀察到局部破損空斑。

7. 細(xì)胞交叉污染
曾有文獻(xiàn)報道統(tǒng)計，目前使用的細(xì)胞株大約有15~20%不是科學(xué)家們所認(rèn)為的細(xì)胞，而在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中，細(xì)胞來源和細(xì)胞株身份鑒定檢測觀念普遍缺乏。細(xì)胞株的交叉污染，常在不經(jīng)意的實驗疏失（不同細(xì)胞株分盤時，共享一瓶培養(yǎng)基、槍頭、移液管忘記更換，而造成不同細(xì)胞株之間的混合污染，或是實驗操作人員錄入錯誤細(xì)胞株名稱，繼代時的培養(yǎng)皿，冷凍細(xì)胞時的凍存管）中發(fā)生，而造成錯誤后續(xù)數(shù)據(jù)搜集；目前常用的細(xì)胞身份驗證的方式包括：短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）、同功酶分析、染色體組分型、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）的特征分析等方法。其中STR，是目前國際細(xì)胞庫（包括：ATCC、DSMZ或是JCRB）常用于細(xì)胞株身份鑒定方法。

三、細(xì)胞老化了

無論是原代細(xì)胞或是細(xì)胞株，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞老化現(xiàn)象是存在且常見的，但卻容易被操作人員忽略，老化的細(xì)胞會出現(xiàn)特征包括：細(xì)胞增殖變慢、細(xì)胞核體積異常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、細(xì)胞體積增大、細(xì)胞扁平、細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象。老化細(xì)胞不會立即死亡，但其基因表達(dá)會發(fā)生變化。

解決辦法：沒有可逆的辦法，只能及時更換新的細(xì)胞。

四、細(xì)胞復(fù)蘇問題

細(xì)胞復(fù)蘇主要考慮凍存的問題，因為復(fù)蘇出問題的可能非常小，因為操作簡單，而且死板，下面這些原因需要逐個排查：
1、凍存的時候是不是消化的時間過長，這是一般人所注意不到的，因為這個問題就兩種肺癌細(xì)胞和一種肝癌細(xì)胞實驗室做過試驗，這個應(yīng)該是絕大部分人細(xì)胞復(fù)不活的一個原因。太長的消化時間會讓細(xì)胞復(fù)蘇時失去貼壁能力，表現(xiàn)為先貼后死，原因是在復(fù)蘇的時候細(xì)胞已進(jìn)入凋亡程序，不可逆轉(zhuǎn)的死亡。
2、凍存液好不好，甘油還是DMSO，質(zhì)量非常重要，否則也會死亡。
3、凍存液的量加的是不是太多，ATCC推薦是不超過7%，大于5%，太多也不好。
4、在凍存的時候是不是把DMSO混均勻，這個有一些影響，但不算太大。
5、凍存是否按部就班，就是所溫度梯度是不是把握嚴(yán)格，很多人容易忘卻這個事情，因為這個東西流程長。
6、如果細(xì)胞污染，是否能很快看到。從這個角度講建議去除離心這步。
7、細(xì)胞在凍存前是否過密。

來源：“碩博醫(yī)學(xué)實驗”公眾號
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