中國工程院食品安全院士團隊

科研成果轉(zhuǎn)化平臺

相信很多老師在細胞培養(yǎng)時，都遇到過細胞養(yǎng)著養(yǎng)著，在顯微鏡下觀察到小黑點，背景比較臟，那么顯微鏡下觀察到了小黑點，是細胞碎片還是污染？

    細胞小黑點判斷   

運動性：很多會動的小黑點，只是發(fā)生布朗運動的細胞碎片。從運動性上比較，浮躁的細菌活躍的多。

培養(yǎng)基的渾濁度：如果在顯微鏡下無法辨認，那就交給時間吧。細胞培養(yǎng)基對于細菌來說是非常營養(yǎng)的大餐。一旦發(fā)生污染，細菌就會大量繁殖。培養(yǎng)基PH值迅速下降，培養(yǎng)基變黃且會變渾濁。通常在12小時內(nèi)就可以發(fā)現(xiàn)，而在48小時內(nèi)就非常明顯。被污染的細胞培養(yǎng)基變黃且渾濁、未被污染的細胞培養(yǎng)基偏紅且澄清。

接種平板：將懷疑污染物接種在微生物培養(yǎng)平板中，觀察菌落形成情況。碎片or細菌？一目了然。

     處理與預防    

1.細胞碎片

化學或者物理的強烈刺激（例如胰酶消化時間過長，吹打細胞太過用力等）往往會導致細胞死亡，產(chǎn)生很多的細胞碎片。在顯微鏡下進行觀察時，可以看到很多呈不規(guī)則形態(tài)、沒有光澤的顆粒粘附在細胞培養(yǎng)皿的底部。

預防方法

狀態(tài)不好的細胞往往貼壁能力較強，因此切勿用移液器進行強力的吹打，從而損害了健康的細胞；另外，控制好胰酶消化的時間，只需保證大部分正常的細胞被消化下來就可以了，然后更換新的細胞培養(yǎng)皿。

處理方法

a. 細胞內(nèi)的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，折光屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變。

b. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞已經(jīng)分泌的分泌泡，可以先換液后用PBS潤洗清除，潤洗不能清除的，可以消化完成后加完全培養(yǎng)基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液750rpm 離心4min，棄上清。再加5ml PBS重懸細胞，再離心后，用完全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

2.細菌污染

細菌污染的細胞，培養(yǎng)基會明顯渾濁，靜置后會在底部形成一層沙狀物，顯微鏡下觀察細胞被細菌包圍死亡。

處理方法

細菌污染檢測，可以取細胞培養(yǎng)上清1ml左右，接種到3ml LB培養(yǎng)基，搖菌過夜。若培養(yǎng)基明顯變渾濁，則證明細菌污染；若無明顯變色，證明無污染。

細菌污染的細胞處理后及時丟棄，不會對其他細胞造成影響。

細胞碎片應(yīng)注意與細菌、真菌污染區(qū)分，主要區(qū)別在于細胞碎片不會明顯增殖，而細菌、真菌在過夜后即可明顯觀察到增殖，甚至完全遮蔽細胞。

細菌污染一般在污染源進入后1-2天即可爆發(fā)，故發(fā)現(xiàn)污染時可以自行溯源。

3.真菌污染

真菌污染的細胞，顯微鏡下可以明顯看到樹枝狀霉菌菌絲或其他形態(tài)的菌體，肉眼可以看到明顯白色斑點或者培養(yǎng)基內(nèi)顆粒狀物質(zhì)漂浮。

真菌無須檢測，顯微鏡及肉眼即可分辨。

處理方法

真菌污染的細胞，處理后及時丟棄，同時需要對培養(yǎng)箱及操作臺進行消毒處理，避免污染其他細胞。

真菌污染一般在污染源進入2-4天內(nèi)即可爆發(fā)，發(fā)現(xiàn)污染時可以自行溯源。

4.支原體污染

支原體污染在國內(nèi)是普遍存在的問題，大部分實驗室缺乏檢測及控制支原體污染的方法，導致有很大比例的細胞含有支原體污染。

檢測方法

支原體檢測方式多種多樣，PCR、熒光法、培養(yǎng)法、試劑盒等，不同實驗方式檢測的靈敏度、特異性、針對的支原體類型都不太一樣，所以各種檢測方法檢出結(jié)果有時會有出入。即同一個樣本，有的方法檢出陽性，有的陰性，有的強有的弱。

支原體處理的，用6孔板培養(yǎng)，每天換液，細胞長滿就傳代丟棄部分，基本可以保證2-3周清除干凈。

5.凋亡小體

體外培養(yǎng)的動物細胞很容易受到培養(yǎng)環(huán)境因素的影響，例如營養(yǎng)成分的改變、氧的供給、毒素、細胞代謝產(chǎn)物的積累、pH、 剪切力、細胞密度及微生物污染等。這些環(huán)境的改變都有可能誘發(fā)細胞的凋亡，從而產(chǎn)生很多分泌的凋亡小體。凋亡小體大多游離在培養(yǎng)基中，但也有一些會通過暴露的核酸彼此之間相互黏連，從而形成一個棕色的凋亡小體團塊，沒有細胞光澤。

處理建議

細胞培養(yǎng)的過程中一定要控制細胞傳代的時間，不能讓細胞"長過"；不要使用過酸或者過堿的培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)；選用內(nèi)毒素含量較低的血清。

6.血清中的沉淀

磷酸鈣是常見的一種沉淀物，通常會使血清出現(xiàn)渾濁，并且在37℃培養(yǎng)的時候會增加。這種沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像小黑點，這些小黑點由于布朗運動看上去可以活動，因此經(jīng)常被誤認為是微生物污染。

處理建議

經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著增多，對于大多數(shù)的細胞而言是不需要進過高溫滅活處理的。

    溫馨提示   

? 哪些步驟最容易發(fā)生污染

最容易導致細菌污染的一個步驟就是細胞在水浴鍋解凍后沒有徹底消毒。如果這個步驟發(fā)生污染的話，細胞接種24小時之內(nèi)就會明顯觀察到細胞污染。

另外幾個可能導致污染的操作是：放培養(yǎng)基的瓶子或者管子在用水浴鍋預熱后，沒有徹底消毒。實驗員在操作過程中槍頭有可能接觸到被污染的部分而導致細胞污染。為了防止這種情況，容器外表面包括帽子應(yīng)噴灑75%乙醇徹底消毒，然后用無菌棉墊擦干。

實驗員在操作過程中，移液器的槍尖可能會碰到超菌臺內(nèi)壁或者超菌臺內(nèi)放置的其他瓶子或設(shè)備，有時可能會碰到包含細胞的細胞培養(yǎng)瓶外表面，甚至會碰到手套，或者實驗操作服的袖口。以上所提到的任何一項操作失誤，都會導致細菌污染。

? 保持無菌工作區(qū)是防止污染最佳方式

1. 使用前和使用后，用75%乙醇對所有工作表面進行消毒。如果操作過程發(fā)生液體溢出的情況，這一項特別重要；

2. 保持一個整潔的工作空間，工作區(qū)應(yīng)該只包含必須的實驗設(shè)備；

3. 在實驗之前確保已經(jīng)準備好所有需要的試劑和耗材，避免反復進出操作區(qū)；

4. 經(jīng)常清潔用于細胞培養(yǎng)的水浴鍋，經(jīng)常對細胞培養(yǎng)箱進行消毒。

? 培養(yǎng)基污染應(yīng)該怎么處理

1. 在使用前和使用后，用75%乙醇對培養(yǎng)基和其他試劑瓶子的外表面進行消毒。此外，不要讓試劑瓶口敞開過長時間；

2. 盡可能將培養(yǎng)基和其他需要的試劑分裝，如果在操作過程中發(fā)生錯誤操作，最好不再使用；

3. 在操作培養(yǎng)基時，請使用一次性的塑料或者玻璃的無菌移液管。每個吸管只有一次，以避免交叉污染；

4. 每天用顯微鏡觀察細胞，密切注意培養(yǎng)基的渾濁度；

5. 避免和其他人共同使用培養(yǎng)基和其他試劑；

6. 每個細胞系使用一瓶培養(yǎng)基。這樣可以有效避免交叉污染；

7. 一次只操作一個細胞系，避免細胞之間的交叉污染。

說明：轉(zhuǎn)載只為分享目的，如有侵權(quán)請聯(lián)系刪除，謝謝！