研究生必備技能：細(xì)胞培養(yǎng)技巧（詳解）
發(fā)布時(shí)間：2023-02-22 瀏覽次數(shù)：391
來源：科研小白的進(jìn)階之路
“ 可能你已經(jīng)是實(shí)驗(yàn)室老江湖了，但誰不希望自己細(xì)胞養(yǎng)的好看一些呢？本文適用于已經(jīng)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的小伙伴，沒有原理，都是干貨～ 建議認(rèn)真閱讀！”
01 — 基礎(chǔ)操作
1. 適合慣用右手的超凈臺(tái)試劑布局
2. 對(duì)于新細(xì)胞心需要觀察摸索最適的消化溫度和時(shí)間，細(xì)胞間隙明顯，大片脫落可移動(dòng)即可終止消化。有些細(xì)胞消化后不會(huì)變圓形，半沙狀即可；
3. 消化后需要輕輕拍打細(xì)胞壁面，震落細(xì)胞；
4. 離心速度不宜過大，1000rpm/min比較適宜
5. 離心后2 mL重旋，呈云霧狀散開即可，吹散次數(shù)過多影響細(xì)胞活力，建議熟練操作；
6. 種板需一步完成，不可補(bǔ)加；
7. 長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，最外圈應(yīng)空出來，加入PBS或空白/陰性對(duì)照，以防培養(yǎng)基蒸發(fā)引起的邊緣效應(yīng)；
8. 把從液氮或-70℃水箱中取出的細(xì)胞在最短的時(shí)間內(nèi)放入水浴鍋中進(jìn)行解凍。
9. 離心前須加入少量培養(yǎng)液。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜（DMSO）濃度較高，注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少其對(duì)細(xì)胞的損傷。如果凍存液的濃度是10％ DMSO，那么加10 ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。但培養(yǎng)基越少細(xì)胞越容易貼附。
10. 血清為混合物，不同品牌/批次存在差異，不同細(xì)胞適用血清品質(zhì)存在差異，應(yīng)做好細(xì)胞試用篩選工作，再囤積足夠量；胎牛血清在-20℃保存可達(dá)5年。
11. 血清滅活處理：4℃溶解，置于56℃ 30 mins.如果血清滅活后有纖維蛋白析出，屬正?，F(xiàn)象；
12. 使用抗生素前，查詢細(xì)胞相關(guān)培養(yǎng)特性，根據(jù)污染類型的鑒別，有針對(duì)性的處理；
13. -80℃凍存效果有限，根據(jù)研究需求，合理凍存，半年以上實(shí)驗(yàn)建議液氮凍存一批；
14. 根據(jù)不同的細(xì)胞類型選擇凍存的細(xì)胞密度。必要的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞最佳凍存密度測(cè)試。
典型的細(xì)胞凍存密度：1-10 ? 10^6 Cells/mL；
細(xì)胞長(zhǎng)期高密度生長(zhǎng)（長(zhǎng)到90%-100%），更容易老化。且對(duì)數(shù)期細(xì)胞增殖速度快，容易聚團(tuán)漂浮。應(yīng)更具研究需要和細(xì)胞生長(zhǎng)特性優(yōu)化傳代密度。
15. 細(xì)胞一旦分化/老化，很難逆轉(zhuǎn)，無法通過外界營(yíng)養(yǎng)體系和生長(zhǎng)條件的改變“起死回生”。
16. 小心取用無菌實(shí)驗(yàn)物品，勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，也不要在打開的容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
17. 每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同也不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以75%酒精擦拭無菌操作臺(tái)面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。
18. 離心管、凍存管等容器需用抗酒精的標(biāo)記筆標(biāo)示內(nèi)容物名稱、操作日期、操作人員姓名。若是細(xì)胞傳代培養(yǎng)，更需注明目前的代數(shù)，以及這是同一代中的第幾盤。
19. 常用的生物安全柜應(yīng)定期用75%酒精對(duì)內(nèi)部工作區(qū)域表面、側(cè)壁、后壁、窗戶進(jìn)行表面凈化；二氧化碳培養(yǎng)箱用75%酒精噴灑消毒后擦干（每月一次）；增濕盤換水（2周1次），蒸餾水漂洗后無紡布或紙擦干，用75%酒精噴灑消毒后擦干，可按比例添加Aquaguard-2支原體預(yù)防試劑（最好預(yù)熱至37℃）。顯微鏡、離心機(jī)也應(yīng)定期擦拭。
20. 在開始養(yǎng)細(xì)胞并傳代時(shí)，也要特別注意凍存細(xì)胞，以保持細(xì)胞有種子庫(kù)存在，可以有效避免細(xì)胞損傷。
21. 胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則細(xì)胞鋪板后生長(zhǎng)狀況會(huì)較差，做流式時(shí)的CD Marker也可能會(huì)下降。胰酶進(jìn)行分裝時(shí)盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因?yàn)槔鋬霰４鏁r(shí)液體體積會(huì)膨脹，多次使用同一瓶胰酶反復(fù)凍融會(huì)降低消化效果并可能造成污染。胰酶適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織和傳代細(xì)胞，如胚胎、上皮、肝、腎等組織，但對(duì)于纖維性組織和較硬的癌組織效果較差。胰酶消化效果主要與pH值、溫度、胰酶濃度、組織塊大小和硬度有關(guān)。
02 — 常見問題解答
1. 細(xì)胞鋪板后狀態(tài)不好：可通過更換其他批次細(xì)胞系，優(yōu)化胰酶消化條件，血清中和量和時(shí)間改善；
2. 細(xì)胞鋪板不勻：消化過度容易造成細(xì)胞整片粘連，結(jié)團(tuán)率高，很難通過吹打分散；不同細(xì)胞接種前，最好進(jìn)行梯度吹打?qū)嶒?yàn)；加樣從孔的左邊靠底部緩慢加入；
3. 每孔之間細(xì)胞量不同：鋪板速度盡量要快；每接幾個(gè)孔細(xì)胞懸液需要混勻一下；加完半邊板后，需要再次講培養(yǎng)皿內(nèi)剩余細(xì)胞懸液充分混勻后鋪板。
4. 血清溶解后有絮狀物：冷凍血清應(yīng)置于4℃冰箱溶解，期間需均勻搖晃，溶解后按需分裝凍存，避免反復(fù)凍融，不宜在4℃長(zhǎng)期儲(chǔ)存。血清的顏色依據(jù)血紅蛋白含量不同而變化。
5. 細(xì)胞污染排查：培養(yǎng)試劑和輔助試劑等條件不變，重新復(fù)蘇一株細(xì)胞，復(fù)蘇時(shí)注意水浴不能沒過凍存管瓶蓋，傳代時(shí)不能觸碰吸管尖頭部或容器瓶口。操作前需要用75%的酒精擦拭無菌操作臺(tái)面。觀察細(xì)胞是否有污染現(xiàn)象。
血清污染排查：其他試劑不變，僅更換血清。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基：其他試劑保持不變，僅更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
PBS：其他試劑保持不變，僅更換PBS。
胰酶：若細(xì)胞復(fù)蘇的很好，一傳代就污染，可以嘗試其他試劑保持不變，僅更換消化用胰酶，看細(xì)胞狀態(tài)。
耗材：培養(yǎng)基及輔助試劑等條件不變，使用新耗材（培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶、槍頭）培養(yǎng)細(xì)胞，觀察細(xì)胞是否有污染。
6. 細(xì)胞不貼壁：胰酶消化時(shí)間不當(dāng)。時(shí)間短，易成團(tuán)；胰酶處理太久，易造成細(xì)胞膜蛋白損傷，嚴(yán)重導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
缺少貼壁因子：血清中含有促貼壁因子，無血清培養(yǎng)基，細(xì)胞貼壁效果下降很多。
其他原因：支原體或細(xì)菌污染；細(xì)胞狀態(tài)不好，細(xì)胞老化；接種細(xì)胞數(shù)目少；復(fù)蘇時(shí)處理速度太慢；培養(yǎng)液配制儲(chǔ)存不當(dāng)（eg:pH過堿，Gln太少）。
解決方法：
貼壁變差：可適當(dāng)加高血清比例（最高不超過20%）；建議試好一個(gè)血清批次多囤一些，可以避免血清批間差對(duì)細(xì)胞的影響。
7. 細(xì)胞老化怎么辦？
防止細(xì)胞老化最主要還是要做到勤觀察、勤換液、勤傳代、勤保種，特別是傳代，不能等細(xì)胞太密了之后傳，一般細(xì)胞建議長(zhǎng)到70％融合度傳代最好；
換培養(yǎng)液應(yīng)該根據(jù)自己細(xì)胞消耗培養(yǎng)基的情況來確定是否該換。如果感覺時(shí)間不好把握的話就多培養(yǎng)幾瓶細(xì)胞，在不同的時(shí)間換液，最后再來比較下，看什么時(shí)候換液好，得出自己的結(jié)論；
選擇正確的血清與培養(yǎng)基：細(xì)胞對(duì)血清特別敏感，直接影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。一定要選擇適合的血清不然就會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不協(xié)調(diào)而導(dǎo)致細(xì)胞老化；
在間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)必然要進(jìn)行消化，但是消化對(duì)細(xì)胞的表面蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的破壞作用，因此不能長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行消化并且在選擇消化酶時(shí)也要選擇較為合適的pH和濃度，不然就會(huì)使細(xì)胞老化或者分化；
8. 293細(xì)胞感染病毒后凋亡嚴(yán)重：
通過更換血清批次，再進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)并觀察轉(zhuǎn)染后的效果，比較分析出原因。
293傳代：鑒于該細(xì)胞貼壁疏松，普通0.25%胰酶消化時(shí)間控制15s-30s；吹打動(dòng)作輕柔，控制在10-20次；細(xì)胞融合率達(dá)到80%傳代即可傳代，不可長(zhǎng)的太滿。
9. 血清渾濁怎么辦？
血清產(chǎn)品中出現(xiàn)沉淀屬于常見現(xiàn)象，無需過多擔(dān)心，并且不會(huì)影響血清的品質(zhì)，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)而言也是沒有任何問題的，可放心使用。若想去除沉淀，我們建議您采用2000 rpm 離心5分鐘，或用0.45 μm的過濾器去除沉淀。
03 — 新手注意事項(xiàng)
1. 水浴鍋未提前預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃直接融化。
2. 水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長(zhǎng)。
3. 離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。
4. 一次復(fù)蘇細(xì)胞種類過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。
5. 判斷細(xì)胞復(fù)蘇成功與否，需要看復(fù)蘇后細(xì)胞貼壁率及細(xì)胞存活率。
定期檢查培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)（即形狀和外觀）
① 細(xì)胞形態(tài)變化的跡象：細(xì)胞核旁顆粒的堆積、細(xì)胞質(zhì)中有空泡、細(xì)胞團(tuán)縮并從平板上脫離、外形變化
② 細(xì)胞形態(tài)變化原因：培養(yǎng)基改變、細(xì)胞污染、細(xì)胞老化、有毒物質(zhì)
PH值降升高：
完全培養(yǎng)基盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，2~8℃下避光保存一周內(nèi)使用完；避免操作時(shí)間過長(zhǎng)。操作時(shí)間快速、減少同時(shí)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)數(shù)量。
PH值降低：
① 及時(shí)傳代、提高傳代比例或降低血清量；
② 適當(dāng)松開瓶蓋；
③ 增加培養(yǎng)液中NaHCO3濃度或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度（NaHCO3含量在2.0 g/L到3.7 g/L之間時(shí)，對(duì)應(yīng)的CO2濃度為5~10%）；
④若是微生物污染造成的，需及時(shí)丟棄培養(yǎng)基，并對(duì)操作、培養(yǎng)空間進(jìn)行消毒處理。
引用：[1] 本文內(nèi)容來自于逍鵬生物，逍鵬生物對(duì)外泌體和細(xì)胞3D培養(yǎng)有相關(guān)經(jīng)驗(yàn)分享。
說明：轉(zhuǎn)載只為分享目的，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系刪除，謝謝！
