產(chǎn)品名稱：plus One step PCR Cloning Kit
產(chǎn)品編號與包裝規(guī)格：
| 編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 產(chǎn)品介紹 | 價格 |
| HKNR005-01A | plus One step PCR Cloning Kit | 20次 | 一步法PCR克隆試劑盒 | 645 |
| HKNR005-01B | 100次 | 2135 |
產(chǎn)品概述：一步定向克隆試劑盒是一款簡單、快速、高效的多片段 DNA 定向克隆產(chǎn)品，可以不依賴于連接酶，不受載體和目的片段的酶切位點限制，直接用同源重組的方法將 PCR 產(chǎn)物定向克隆至任意載體的任意位點，完成目的片段與載體相連接的基因克隆技術(shù)。該技術(shù)操作簡單，PCR 產(chǎn)物一步定向克隆，目的片段與載體無縫連接，反應(yīng)時間短至 10 分鐘，陽性率達(dá)到95%以上，讓您輕松完成實驗。
plus One step PCR Cloning Kit 反應(yīng)原理：
保存條：-20℃保存。
產(chǎn)品組成：
| 產(chǎn)品組成 | A包裝（20次） | B包裝（100次） |
| Plus 重組酶 | 20μL/管 | 100μL/管 |
| 5×反應(yīng)緩沖液 | 200μL/管 | 1mL/管 |
| pUC19 線性化預(yù)處理載體，50ng/μL | 20μL /管 | 20μL/管 |
| 800bp PCR 片段（陽性對照），50ng/μL | 20μL /管 | 20μL /管 |
| 2×Specific Taq Master Mix | 1mL | 1mL×5 |
plus One step PCR Cloning Kit 操作流程：
1、載體制備：選取合適的位點，單酶切，雙酶切或 PCR 擴增皆可，并且 5'端突出，3'端突出或平末端均適用本Kit。由于單酶切線性化程度差，且為了提高陽性率， 我們建議您采取雙酶切載體。最終載體的濃度>15ng/μL，(高濃度的載體有利于提高效率)。
2、引物設(shè)計：使用一步定向克隆試劑盒時，引物設(shè)計非常重要，總原則是通過引物 5'端引入同源重組序列，擴增產(chǎn)物之間以及擴增產(chǎn)物與線性化克隆載體之間都具備能夠相互同源重組的完全一致的序列。即在遵循引物設(shè)計基本原則的前提下，只需在上下游引物要加上15-20bp 的載體同源序列。具體參考下圖：
3、目的片段獲得：目的片段通常通過 PCR 獲得，為保證PCR 擴增的特異性及靈敏度，請盡可能選用高保真酶，推薦使用環(huán) 凱Fast Pfu DNA 聚合酶（貨號：HKE031）。PCR每條引物長度至少在 40-45bp，包括 5'端與載體同源的15-20bp 以及目的片段特異性序列 20-25bp（注意事項： 如果是表達(dá)載體克隆構(gòu)建，引物設(shè)計完成后，請注意檢查讀碼框是否正確）。
注：PCR 擴增結(jié)束后如有雜帶，需切膠回收，否則雜帶會影響重組反應(yīng)。
4、目的基因與載體連接
a，于冰盒上將線性化載體與目的片段以一定的摩爾比加入到離心管中進行重組反應(yīng)（各組分加量根據(jù)下方公式計算），反應(yīng)體系見下表：
*：當(dāng)載體加入量為100~200ng 時，可獲得較高的重組效率。
**：4~6 片段連接建議各片段的引物同源臂長度大于 20bp，各片段與載體的摩爾比分別為1:1，反應(yīng)時間可延長到30min，最長不要超過 1h。
各組分加量計算公式：
b，反應(yīng)結(jié)束可直接進行轉(zhuǎn)化，若不轉(zhuǎn)化需儲存在 4℃ 或-20℃。
5、反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板（我們建議所使用的感受態(tài)細(xì)胞效率要達(dá)到或>1×107cfu/μg。轉(zhuǎn)化步驟如下：）
a，冰上融化一管 100μL 的DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，輕彈管壁使細(xì)胞重懸起來。加入 10μL 的反應(yīng)液到感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈數(shù)下，冰浴30min。
b，42℃水浴中熱激90 秒后快速放入冰上 5 分鐘。
c，加入500μL SOC 或LB 液體培養(yǎng)基，37℃孵育45-60 分鐘。
d，5000rpm 離心 3 分鐘收集菌體，根據(jù)需要將一定量的菌體均勻的涂布在含抗生素平板上。
注：為了驗證載體酶切完全，建議做轉(zhuǎn)化的同時做一個空載體作為對照。在載體處理好的情況下，對照應(yīng)無克隆生長！
6、陽性克隆鑒定：一般的，我們建議采用菌落 PCR 進行陽性克隆鑒定，推薦使用環(huán)凱2×Specific Taq Master Mix（貨號：HKE010）。
鑒定引物的選擇：為了避免假陽性結(jié)果，我們建議一條引物為載體特異性引物，另一條引物為目的片段特異性引物。
