【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：傳染性皮下和造血組織壞死病毒（IHHNV）核酸檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎ?/p>
【產(chǎn)品簡(jiǎn)介】
本試劑盒適用于水產(chǎn)樣本中傳染性皮下和造血組織壞死病毒（IHHNV）的檢測(cè)。
【檢測(cè)原理】
基于實(shí)時(shí)熒光 PCR技術(shù)，針對(duì)IHHNV特異性基因設(shè)計(jì)引物和熒光探針并優(yōu)化反應(yīng)所需試劑組分，加入待檢樣品核酸即可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在擴(kuò)增過(guò)程中，熒光探針與目的基因片段結(jié)合，可被Taq酶分解并產(chǎn)生熒光信號(hào)，此時(shí)熒光定量PCR儀可識(shí)別該熒光信號(hào)，同時(shí)根據(jù)其強(qiáng)弱變化繪制出相應(yīng)的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，進(jìn)而判定IHHNV是否檢出。
【產(chǎn)品組分】
組分名稱 | 規(guī)格×數(shù)量 |
裂解液 | 1 mL×2管 |
陽(yáng)性對(duì)照 | 200 μL×1管 |
陰性對(duì)照 | 200 μL×1管 |
預(yù)混液 | 1 mL×1管 |
說(shuō)明書 | 1份 |
【儲(chǔ)存條件與保質(zhì)期】
-20℃儲(chǔ)存，有效期為9個(gè)月，避免反復(fù)凍融。
【靈敏度】
最低檢驗(yàn)限：10-100 Copies/Test
【所需其他材料和適用儀器】
熒光定量PCR儀（具有能夠檢測(cè)FAM標(biāo)記的熒光通道）、高速離心機(jī)、移液器、移液槍頭及離心管等。
【使用指南】
1. 樣品前處理
取50 mg左右（約黃豆粒大小）的組織樣品（對(duì)蝦鰓、胃及各期蝦苗幼體）于玻璃勻漿器中勻漿，勻漿后置于1.5 mL離心管中。
2. DNA提取
1）對(duì)上述處理好的樣品加入50 μL裂解液，100℃恒溫處理10分鐘，13000 rpm離心5分鐘，上清即含待檢測(cè)樣品DNA。如不立刻開展檢測(cè)請(qǐng)將上清液轉(zhuǎn)移至0.2 mL無(wú)菌離心管中，-20℃保存。
2） DNA的提取也可以采用商品化的水生動(dòng)物病毒核酸提取試劑盒進(jìn)行提取，請(qǐng)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。
3. 加樣、反應(yīng)
1) 按照需求取n個(gè)PCR反應(yīng)管（n=待檢測(cè)樣品數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照），從試劑盒中取出預(yù)混液，充分融化，渦旋振蕩后短暫離心，向以上每個(gè)PCR管中加入20 μL預(yù)混液。
2) 向上述n個(gè)反應(yīng)管中分別按順序加入陰性對(duì)照、待測(cè)樣品DNA、陽(yáng)性對(duì)照各5 μL，加樣后立刻蓋緊管蓋，短暫離心，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
3) PCR反應(yīng)體系為25 μL，設(shè)置FAM檢測(cè)通道讀取，在反應(yīng)階段2中60℃時(shí)收集熒光信號(hào)，具體程序如下：
反應(yīng)階段 | 溫度 | 時(shí)間 | 信號(hào)收集 | 循環(huán)數(shù) | |
1 | 95℃ | 30 sec | 1 | ||
2 | 95℃ | 5 sec | 40 | ||
60℃ | 30 sec | √ |
注：對(duì)于ABI系列熒光定量PCR儀器，其反應(yīng)體系中無(wú)需添加ROX，且在軟件設(shè)置時(shí)，在“Passive Reference”和“Quencher”處均選擇“None”。
4. 結(jié)果
一般情況下，可通過(guò)軟件自動(dòng)設(shè)定的基線、閾值等直接讀取檢測(cè)結(jié)果。如需調(diào)整，可根據(jù)所使用儀器的自身情況（如噪聲等）以及選取的不同熒光通道進(jìn)行調(diào)整。
1) 質(zhì)量控制：
陰性對(duì)照未出現(xiàn)明顯的S型擴(kuò)增曲線或Ct值＞37，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線且其Ct值＜30。若陰陽(yáng)性對(duì)照未同時(shí)滿足上述條件，則本次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，應(yīng)重新檢測(cè)或與產(chǎn)品技術(shù)支持聯(lián)系。
2) 結(jié)果判讀：
① 無(wú)Ct值，且未出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線，為陰性結(jié)果，判定為IHHNV未檢出；
② Ct值≤37，且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線，為陽(yáng)性結(jié)果，判定為IHHNV檢出；
③ Ct值＞37，且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線，建議重新檢測(cè)，若重檢后Ct值≤37，且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線，則判定為陽(yáng)性結(jié)果，反之則為陰性結(jié)果。
