一種檢測阪崎腸桿菌的“一混即讀”策略
發(fā)布時間：2024-11-08 瀏覽次數(shù)：287
食品中致病菌的快速檢測是保障食品安全的關鍵，尤其是在嬰幼兒配方奶粉中常見的阪崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii）。傳統(tǒng)檢測方法如培養(yǎng)法耗時長，難以滿足快速檢測需求。本文提出了一種基于納米抗體（nanobody）誘導金納米粒子（AuNPs）聚集的比色傳感器，通過“一混即讀”的方法實現(xiàn)對阪崎腸桿菌的快速檢測。
1. 納米抗體誘導金納米粒子聚集的機制
納米抗體具有優(yōu)異的生化特性，可特異性識別細菌表面抗原，并導致AuNPs聚集。在加入阪崎腸桿菌后，納米抗體與細菌結(jié)合，空間位阻抑制AuNPs進一步聚集，從而產(chǎn)生顏色變化，使溶液從藍色恢復為紅色（圖1）。這一現(xiàn)象為“一混即讀”檢測提供了簡單而靈敏的比色信號。
圖1. 基于納米體誘導AuNPs聚集的阪崎梭菌“混合-讀取”比色免疫傳感器的制備。
圖2展示了納米體誘導AuNPs聚集的表征。圖2A顯示在目標細菌存在或不存在的情況下，納米體對AuNPs聚集的影響示意圖。2B為AuNPs溶液的紫外-可見吸收光譜，AuNPs溶液與含和不含坂崎菌的納米體溶液混合。不同條件下添加Nb?Es6 (E?H) TEM圖像前后AuNPs的粒徑(C)和zeta電位(D)的變化。(E) AuNPs溶液的TEM圖像。2F僅Nb?Es6存在時AuNPs溶液的TEM圖像。(G) Nb?Es6和C. sakazakii存在下AuNPs溶液的TEM圖像。2H為AuNPs溶液的TEM圖像。
圖2. 納米體誘導AuNPs聚集的表征。
此外，為了確定納米體誘導的聚集是否是一種普遍現(xiàn)象，我們測試了7種類型的納米體，發(fā)現(xiàn)它們都能誘導AuNPs的聚集（圖3A）。并進一步闡明納米體誘導檸檬酸鹽覆蓋的AuNPs聚集的機制，發(fā)現(xiàn)檸檬酸鹽覆蓋的AuNPs在pH值6 ~ 10范圍內(nèi)保持穩(wěn)定（圖3B）。在納米體存在的情況下，在pH值為6?10的范圍內(nèi)，檸檬酸覆蓋的AuNPs的顏色和光譜發(fā)生了顯著變化。如圖3C所示，當pH值低于納米體的等電點（pI）時（pH值為6.93）（圖3D），由于帶正電的納米體和帶負電的檸檬酸鹽覆蓋的AuNPs之間存在強大的靜電引力，檸檬酸鹽覆蓋的AuNPs會發(fā)生嚴重的聚集和沉淀。在納米體的pI附近，由于納米體的正電荷逐漸減少，檸檬酸鹽覆蓋的AuNPs的聚集程度受到抑制。此外，當pH值超過pI時，納米體和檸檬酸覆蓋的AuNPs都攜帶負電荷，但檸檬酸覆蓋的AuNPs聚集持續(xù)存在。因此，這表明納米體誘導的檸檬酸鹽端金納米顆粒聚集不僅僅涉及簡單的靜電吸引。為了驗證不同溶劑對聚集效應的影響，研究人員首先在150 μL的AuNPs中加入10 μL PBS、純凈水和納米體（3 μg/mL），并在5 min后用紫外可見分光光度法測量吸光度峰。研究結(jié)果顯示，只有納米體顯著改變了AuNPs的吸光度峰，并伴有顏色從紅色到藍色的變化（圖3E）。接著繼續(xù)探索了AuNPs與其他生物分子（包括血清蛋白和脫脂奶粉）的相互作用。作為對照，將10 μL 30 μmL納米體加入150 μL與10 μL不同濃度（3、30、300、3000 μg/mL）的BSA預混的AuNPs溶液中，觀察到當BSA濃度低于300 μg/mL時，AuNPs溶液中有明顯的聚集現(xiàn)象。然而，隨著濃度的繼續(xù)增加，聚集作用明顯減弱，幾乎沒有觀察到聚集，AuNPs溶液呈現(xiàn)酒紅色（圖3F）。一種可能的解釋是，一些蛋白質(zhì)可以通過在AuNPs表面形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)冠狀體來阻礙納米體誘導的AuNPs聚集（圖3G）。為了進一步了解納米體誘導AuNPs聚集的過程，我們在4種AuNPs溶液中分別加入4 μL 30 μg/mL的納米體，每3分鐘在一個孔中加入10 μL 3000 μg/mL的BSA。紫外-可見光譜結(jié)果顯示，加入BSA后，AuNPs溶液的狀態(tài)迅速穩(wěn)定，阻止了進一步的聚集（圖2H）。這一觀察結(jié)果強調(diào)了納米體誘導AuNPs聚集的漸進性質(zhì)。此外，發(fā)現(xiàn)不同濃度的納米體會影響AuNPs的聚集動力學。AuNPs -納米體復合物的紅外光譜顯示出酰胺I波段峰的變化，從1625到1631 cm?1（圖2I）。酰胺I帶的這些變化表明，觀察到的這些蛋白質(zhì)的構象改變是它們與AuNPs相互作用的結(jié)果，對應于C=O拉伸。
圖3. 納米體誘導AuNPs聚集的原理分析。
2. 高靈敏度與特異性
基于上述分析，檸檬酸末端金納米顆粒在水中分散良好，使溶液呈現(xiàn)紅色。在納米體存在的情況下，檸檬酸終止的金納米顆粒被誘導聚集，導致顏色從紅色變?yōu)樗{色。然而，當納米體與不同濃度的阪坂曲菌結(jié)合時，由于細菌細胞的微米尺度，AuNPs保持自由分散，因此520 nm處的紫外吸收峰隨著細菌濃度的降低而逐漸降低（圖4B）。實驗表明，該檢測方法肉眼可見的檢測限為103 CFU/mL，定量檢測限可達136 CFU/mL（圖4E）。
圖4. “混合-讀取”比色免疫傳感器檢測性能評價。
平臺在20分鐘內(nèi)完成檢測，且對其他細菌（如大腸桿菌、沙門氏菌等）無交叉反應，表現(xiàn)出良好的特異性，適用于復雜樣本（圖5）。
圖5. 特異性及穩(wěn)定性評估。
3. 在實際樣本中的應用
該比色傳感器成功應用于嬰兒配方奶粉的阪崎腸桿菌檢測，實驗獲得的檢測回收率在80.3%至89.9%之間，證實了方法在復雜食品基質(zhì)中的可靠性和實用性。
總結(jié)：基于納米抗體誘導的AuNPs聚集技術，為快速、無標記、經(jīng)濟的致病菌檢測提供了創(chuàng)新手段。該“一混即讀”平臺具備廣闊的食品安全檢測應用潛力，特別適合用于便攜式現(xiàn)場檢測。
參考文獻：Chen, Pengyu, et al. "Nanobody-Induced Aggregation of Gold Nanoparticles: A Mix-and-Read Strategy for the Rapid Detection of Cronobacter sakazakii." Analytical Chemistry (2024).
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~高寶
