大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備實驗
發(fā)布時間：2024-07-24 瀏覽次數(shù)：128
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簡介
在大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備實驗中，通過特殊方法（如電擊法或CaCl2法）處理細胞，使得細胞膜的通透性暫時性地發(fā)生改變，從而形成能夠允許外源DNA分子進入的細胞，這些被稱為感受態(tài)細胞（Component cells）。
大腸桿菌蛋白表達系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用，是經(jīng)濟實惠的蛋白表達系統(tǒng)之一。該系統(tǒng)具有清晰的遺傳背景、快速的細胞增殖、高表達量、良好的穩(wěn)定性以及強大的抗污染能力等特點，因此適用于多種蛋白的表達。
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實驗原理
在大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備實驗中，外源DNA的重組質(zhì)粒在體外組裝完成后，需要引入宿主細胞中。這個過程發(fā)生在細胞進行大規(guī)模復(fù)制和繁殖時，才能獲得純凈的重組質(zhì)粒DNA，這個過程稱為轉(zhuǎn)化。通過一些特殊的方法，如使用CaCl2、RuCl等化學(xué)試劑處理，可以改變受體細胞的細胞膜通透性，使其能夠容納外源DNA的載體分子。
CaCl2法制備感受態(tài)細胞（圖源網(wǎng)絡(luò)）
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實驗準備
1.實驗材料、試劑
E. coli DH5α菌株、LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、CaCl2、硫酸鎂、SOB、TFB。
2.儀器耗材
培養(yǎng)皿、恒溫搖床、聚丙烯管、電熱恒溫培養(yǎng)箱、臺式高速離心機、無菌工作臺、燒瓶、恒溫水浴鍋、低溫冰箱、制冰機、分光光度計、微量移液槍、錐形瓶、試管。
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實驗步驟
1.從經(jīng)過37℃培養(yǎng)16-20小時的培養(yǎng)平板中挑選一個單獨的菌落（直徑為2-3毫米），并將其轉(zhuǎn)移到一個含有100毫升LB或SOB培養(yǎng)基的1升燒瓶中。在37℃下強烈振蕩培養(yǎng)3小時。根據(jù)一般經(jīng)驗，1個OD600（光學(xué)密度為600納米）約相當于含有大腸桿菌DH5α 10^9個/mL。
2.將細菌轉(zhuǎn)移到一個經(jīng)過消毒、只使用一次的、事先用冰冷卻的50毫升聚丙烯管中。將培養(yǎng)物置于冰上靜置10分鐘，使其冷卻至0℃。
3.在4℃條件下，使用Sorvall GS3特制離心頭（或類似的離心頭），以每分鐘4,100轉(zhuǎn)的速度離心10分鐘，以回收細胞。
4.倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。
5.每50毫升的起始培養(yǎng)液使用30毫升預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2-MgCl2 溶液（80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2）重新懸浮每份細胞沉淀。
6.于4℃用Sorvall GS3轉(zhuǎn)頭（或與之相當?shù)霓D(zhuǎn)頭）以4100 r/min離心10 min，以回收細胞。
7.倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。
8.每50 ml初始培養(yǎng)物用2 ml用冰預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重懸每份細胞沉淀。
9.此時，可以用新鮮制備的感受態(tài)細胞直接做轉(zhuǎn)化實驗，也可以將細胞凍存于-70℃。
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感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化中的影響因素
1. 細胞的生長狀態(tài)和密度
從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細胞數(shù)在5×107個左右為佳。對于TG1菌株，當OD600為0.5時，細胞密度在5×107個/ml左右。受體細胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時，可加入占總體積10%-15%的無菌甘油或-70℃保存。
2. 質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度
用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)為超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比。加入的外源DNA量過多或體積過大會使轉(zhuǎn)化率下降。DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細胞體積的5%。質(zhì)粒分子量過大的轉(zhuǎn)化效率低，大于30kb的重組質(zhì)粒難以進行轉(zhuǎn)化。重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較線性重組質(zhì)粒高10~100倍。
3. 試劑的質(zhì)量
所用的CaCl2等試劑應(yīng)是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4℃。
4. 防止雜菌和雜DNA的污染
操作過程應(yīng)在無菌條件下進行，使用新的離心管、移液槍頭，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有試劑都要滅菌，并注意防止被其他試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。
5. 操作需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉(zhuǎn)化率將會降低。
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注意事項
1. 為確保高效轉(zhuǎn)化，細胞活力應(yīng)保持在每毫升10^8個細胞以下，對于大多數(shù)散大腸桿菌而言，相應(yīng)的光學(xué)密度（OD值）約為0.4左右。為避免細菌培養(yǎng)物的生長密度過高，建議每15-20分鐘測定一次OD600值以進行監(jiān)測。通過記錄監(jiān)測時間和OD值，可制作一個圖表來預(yù)測培養(yǎng)物達到OD600值0.4所需的時間。當OD600值達到0.35時，即可收獲細菌培養(yǎng)物。
2. 不同生長階段的菌株間，OD值與每毫升中活細胞數(shù)量存在顯著變化。為了標準化，需測量特定大腸桿菌菌株在其生長周期中不同時間點的OD600值，并將每個稀釋度的培養(yǎng)物均勻涂布在不含抗生素的LB瓊脂板上，以計算每個時期的活細胞數(shù)量，以確保分光光度計的讀數(shù)標準化。
3. 大多數(shù)大腸桿菌（除了MC106）在轉(zhuǎn)化中使用TFB替代CaCl2可以獲得相同或更好的結(jié)果。根據(jù)1979年Dagert和Ehrlieh的實驗，細胞在4℃條件下可在CaCl2溶液中保存24-48小時。在最初12-24小時的儲存過程中，轉(zhuǎn)化率增加了4-6倍，然后逐漸降低至初始水平。
4. 選擇新鮮平板的單克隆以確?？寺〉男迈r程度，即剛涂布生長過夜的平板。
5. 菌體的OD600值對轉(zhuǎn)化效率有影響，JM109或BL21的OD值為0.35，DH5α為0.4，應(yīng)盡量避免過高的OD值，不得超過0.6。
6. 在低溫處理后，應(yīng)在冰上保存12-24小時后分裝，并冷凍保存于-80℃。
7. 所有用品（如離心管、藥瓶等）應(yīng)使用新的，若使用舊的，則必須確保其干凈，并準備好CaCl2溶液。
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