細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)大全（增殖與毒性檢測(cè)、周期檢測(cè)、凋亡檢測(cè)）
發(fā)布時(shí)間：2023-05-09 瀏覽次數(shù)：287
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細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)（CCK8 法）
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/strong>通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活力來(lái)驗(yàn)證目的基因?qū)?xì)胞增殖的影響，或驗(yàn)證某種藥物對(duì)細(xì)胞的毒性。
二、實(shí)驗(yàn)原理：Cell Counting Kit-8(簡(jiǎn)稱 CCK8) 試劑中含有 WST-8?；罴?xì)胞特別是增殖期細(xì)胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能夠使 WST-8 還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收值，即可間接反映細(xì)胞增殖情況。
三、細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)（CCK8 法）實(shí)驗(yàn)步驟
1. 將細(xì)胞以 104-105 個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在 96 孔板 中，加入 100μL 培養(yǎng)基，含或不含待測(cè)化合物。在 CO2 培養(yǎng)箱中在 37℃ 下培養(yǎng)細(xì)胞 24 小時(shí)。
2. 向板中加入 10μL 不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。
3. 在培養(yǎng)箱中將培養(yǎng)板培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間（如 6、12、24 或 48 小時(shí)）。
4. 向板的每個(gè)孔中加入 10μL CCK-8 溶液。小心不要將氣泡引入孔中。
5. 將平板在培養(yǎng)箱中孵育 1-4 小時(shí)。
6. 在讀板之前，在定軌振蕩器上輕輕混勻。
7. 使用酶標(biāo)儀測(cè)量 450nm 處的吸光度。
四、常見(jiàn)問(wèn)題及解答
Q1：做細(xì)胞活性檢測(cè)時(shí)，每孔應(yīng)該接種多少個(gè)細(xì)胞？
A：當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn) 96 孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞一般最小接種量為 1,000 個(gè)/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于 2,500 個(gè)/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)，當(dāng)然，也有部分極其靈敏的試劑盒或可檢測(cè)更少量的細(xì)胞。
Q2：若是使用 6 孔或者 24 孔板進(jìn)行試驗(yàn)，CCK 試劑使用量怎么樣呢？
A：如果要使用 6 孔板或 24 孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的 10% 加入 CCK8 溶液。
Q3：培養(yǎng)基的本底顏色如酚紅會(huì)不會(huì)影響細(xì)胞活性的檢測(cè)呢？
A：不會(huì)的，培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光值而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。
Q4：只可以在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè) OD 值嗎？
A：可以在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè) OD 值，但是若無(wú)此波長(zhǎng)的濾光片，可選擇吸光度在 430-490 nm 之間的濾光片，但是 450 nm 濾光片的檢測(cè)靈敏度最高。
Q5：若是暫不檢測(cè) OD 值，該如何處理？
A：若暫時(shí)不測(cè)定 OD 值，可以向每孔中加入 10 μL 0.1 M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24 小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
Q6：在實(shí)驗(yàn)中 OD 值太高，怎么解決？
A：CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時(shí)間由 2 小時(shí)縮短為 1 小時(shí)。此外，可適當(dāng)減少細(xì)胞的數(shù)量。
Q7：應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？
A：建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的，但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣。對(duì)于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞，建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
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細(xì)胞周期檢測(cè)（PI 法）
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/strong>通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) DNA 含量的變化，檢測(cè)外界干預(yù)手段對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響。
二、實(shí)驗(yàn)原理：
細(xì)胞周期（cell cycle）：是指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過(guò)程，通常由 G0/G1 期、S 期、G2/M 期組成。G0/G1 期：二倍體細(xì)胞的 DNA 含量 (2N)。S 期：DNA 開(kāi)始合成，這時(shí)細(xì)胞核內(nèi) DNA 的含量介于 G1 期和 G2 期之間。G2/M 期：DNA 復(fù)制結(jié)束成為 4 倍體（4N)。
碘化丙啶 (Propidium, PI)PI 為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸 DNA 或 RNA 雙鏈螺旋的堿基之間，產(chǎn)生紅色熒光，并且熒光強(qiáng)度和所嵌入的核酸含量成正比。細(xì)胞周期檢測(cè)時(shí)，首先用 RNA 酶將 RNA 消化排除影響，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) PI 熒光強(qiáng)度直接反映細(xì)胞各時(shí)相的 DNA 分布狀態(tài)，從而計(jì)算出各時(shí)相的百分率。
三、細(xì)胞周期檢測(cè)（PI 法）實(shí)驗(yàn)步驟
1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：待各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞融合度達(dá)到 70%，用胰酶消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來(lái)時(shí)，加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000 g 左右離心 3 分鐘，沉淀細(xì)胞。小心吸除上清。加入 1 毫升冰浴預(yù)冷的 PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到 1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。
對(duì)于懸浮細(xì)胞：收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，1000 g 左右離心 3 分鐘，沉淀細(xì)胞。小心吸除上清，加入 1 毫升冰浴預(yù)冷的 PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到 1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。
2. 細(xì)胞固定：加入 1 毫升冰浴預(yù)冷 70% 乙醇，輕輕吹打混勻，4℃ 固定過(guò)夜。1000 g 左右離心 3 分鐘，沉淀細(xì)胞。小心吸除上清，加入 1 毫升冰浴預(yù)冷的 PBS，重懸細(xì)胞。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。
3. 碘化丙啶染色液的配制：參考下表，根據(jù)待檢測(cè)樣品的數(shù)量配制適量的碘化丙啶染色液，現(xiàn)配現(xiàn)用：
染色：每管細(xì)胞樣品中加入 0.5 毫升碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀， 37℃ 避光溫浴 30 分鐘。
流式檢測(cè)和分析：用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng) 488nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況。采用分析軟件進(jìn)行細(xì)胞 DNA 含量分析和光散射分析。
四、常見(jiàn)問(wèn)題及解答
Q1：是否可以直接用乙醇固定細(xì)胞?
A：不可以，直接 70～75% 乙醇加入很容易導(dǎo)致細(xì)胞聚團(tuán)現(xiàn)象，很難重懸成單細(xì)胞，影響固定效果，其至容易導(dǎo)致固定后無(wú)細(xì)胞沉淀的現(xiàn)象。正確做法是: 待細(xì)胞, 充分分散成單細(xì)胞后，緩慢地滴入無(wú)水乙醇中，使其終濃度為 70～75%7 醇。
Q2：細(xì)胞量過(guò)少，無(wú)法獲得數(shù)據(jù)結(jié)果?
A：首先，要保證收集足夠的細(xì)胞樣品 (個(gè)人經(jīng)驗(yàn)至少收集 100 萬(wàn)左右): 如果藥物處理后。細(xì)胞死亡過(guò)多，應(yīng)該降低藥物濃度；其次，固定細(xì)胞時(shí)先用預(yù)冷的 PBS 重懸細(xì)胞，再逐滴滴入無(wú)水乙醇中；細(xì)胞清洗時(shí)，不可過(guò)度吹打細(xì)胞，以防產(chǎn)生過(guò)多的細(xì)胞碎片。最后，盡量采用尖底的離心管和水平的離心機(jī)，離心后盡量用移液槍吸走上清，不要傾倒，殘留一點(diǎn)，不要吸完。
Q3：什么樣的數(shù)據(jù)結(jié)果可以用?
A：G2/M 期細(xì)胞的 DNA 含量是 G1 期的 2 倍，在直方圖上形成一個(gè) 2 倍于 G1 信號(hào)峰的高斯峰；CV(變異系數(shù)) 表示峰的寬度，CV 值越小，峰形越好，最好是在 5% 左右，一般小于 10%
也被認(rèn)可。RCS 最好是在 1～3，高于 5 則不被認(rèn)可。RCS 高，說(shuō)明數(shù)據(jù)的分布和軟件所建立模型的預(yù)期值的差別比較大，可能由于處理細(xì)胞的時(shí)候 RNA 酶消化不好，或者是 PI 的濃度不佳造成的。
Q4：如何提高分辨率和精確度?
A：變異系數(shù) (Coefficient of Variation，CV 值) 反映 G0/G1 峰分辨率和精確度。而樣品 CV 值為樣品固有，與樣本制備過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)量有關(guān)。細(xì)胞碎片越少、細(xì)胞聚團(tuán)越少、RNA 酶消化越充分，可以減少樣本的 CV 值，提高 G0/G1 峰分辨率和精確度。
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細(xì)胞凋亡檢測(cè)（Annexin V-FITC 雙染法）
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/strong>通過(guò)檢測(cè)處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)量來(lái)檢驗(yàn)?zāi)康幕蚺c細(xì)胞凋亡的關(guān)聯(lián)或者藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
二、實(shí)驗(yàn)原理：
在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸 (phosphotidylserine，PS) 位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡細(xì)胞中，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。
Annexin-Ⅴ能與 PS 高親和力結(jié)合?？赏ㄟ^(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。用標(biāo)記了 FITC 的 AnnexinⅤ作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。細(xì)胞壞死的過(guò)程中也會(huì)發(fā)生細(xì)胞膜損傷，壞死的細(xì)胞會(huì)結(jié)合 Annexin V-FITC。
Annexin V-FITC 通常與細(xì)胞膜非滲透性核酸熒光染料聯(lián)合使用以檢測(cè)凋亡細(xì)胞。常用的染料是 PI。正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜是完整的，核酸染料 Propidium iodide(PI) 不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI 能夠透過(guò)細(xì)胞膜與細(xì)胞核結(jié)合呈現(xiàn)紅色。
將 AnnexinⅤ與 PI 匹配使用，可以將凋亡早期的細(xì)胞和晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。壞死細(xì)胞可以同時(shí)與 Annexin V-FITC 和 PI 結(jié)合顯色，而 PI 則被排除在活細(xì)胞 (FITC 陰性) 和早期凋亡細(xì)胞 (FITC 陽(yáng)性) 之外。在沒(méi)有巨噬細(xì)胞的情況下，凋亡的最后階段會(huì)像細(xì)胞壞死一樣發(fā)生整個(gè)細(xì)胞的解體，從而使凋亡晚期的細(xì)胞也同時(shí)被 FITC 和 PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽(yáng)性。
五、細(xì)胞凋亡檢測(cè)（Annexin V-FITC 雙染法）實(shí)驗(yàn)步驟
1. 待各實(shí)驗(yàn)組 6 孔板細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋率約為 70% 時(shí)，收集上清，胰酶消化貼壁細(xì)胞，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，與上清細(xì)胞收集于同一 5 mL 離心管中，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔 (為保證上機(jī)細(xì)胞數(shù)足夠，細(xì)胞數(shù)目 ≥ 5×105/處理）。若為懸浮細(xì)胞，直接收集。
2.1000 g 離心 5 分鐘，棄上清，用 PBS 輕輕重懸細(xì)胞；
3.1000 g 離心 5 分鐘，棄上清，加入 195μl Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
4. 加入 5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
5. 加入 10μl 碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
6. 使用鋁箔進(jìn)行避光，室溫 (20-25℃) 避光孵育 10-20 分鐘，孵育過(guò)程中重懸細(xì)胞 2-3 次，隨后置于冰浴中。
7. 立即上機(jī)檢測(cè)
四、常見(jiàn)問(wèn)題及解答
Q1：構(gòu)建了慢病毒轉(zhuǎn)染的穩(wěn)轉(zhuǎn)株（帶綠色熒光），檢測(cè)凋亡使用 FITC 也是綠色熒光，是否會(huì)干擾？
A：會(huì)有干擾，可以換紅色熒光標(biāo)簽的試劑進(jìn)行檢測(cè)。
Q2：鏡下觀察有很多漂浮細(xì)胞，可以看到凋亡，為什么染色后跑流式，凋亡比例跟 control 差不多？
A：將漂浮的細(xì)胞收集起來(lái)再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
Q3：Annexin V-FITC 和 PI 在激光共聚焦顯微鏡下分別選擇的測(cè)量波長(zhǎng)是多少？
A：綠色熒光可以使用 488nm 激發(fā)，PI 是紅色熒光，使用 535nm 激發(fā)
Q4：FITC 和 PI 孵育時(shí)間過(guò)短，對(duì)結(jié)果有什么影響？
A：孵育時(shí)間過(guò)短，影響裝載效果，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也要考慮細(xì)胞本身的狀態(tài)。
Q5：想問(wèn)一下用流氏檢測(cè)應(yīng)該怎么設(shè)門？
A：用陰性未染色的細(xì)胞調(diào)電壓，門設(shè)置，annexin V-FITC 單染、PI 單染來(lái)調(diào)補(bǔ)償。
來(lái)源：" Super Lab"公眾號(hào) 小編：red red sea
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