【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：桃拉病毒（TSV）核酸檢測試劑盒（RT-PCR熒光探針法）
英文名稱：
【包裝規(guī)格】
【產(chǎn)品編號】
【產(chǎn)品簡介】
本試劑盒適用于對蝦水產(chǎn)病害桃拉病毒（TSV）的檢測。
【檢測原理】
基于實時熒光RT-PCR技術(shù)，利用針對于TSV檢測的特異性基因合成相應(yīng)的引物和熒光探針，加入其他反應(yīng)所需試劑以及待檢核酸樣品，即可進行擴增反應(yīng)。在發(fā)生擴增過程中，熒光探針與目的基因片段結(jié)合，可被Taq酶分解并產(chǎn)生熒光信號，此時熒光定量PCR儀可識別該熒光信號，同時根據(jù)其強弱變化繪制出相應(yīng)的實時擴增曲線，進而判定TSV是否檢出。
【產(chǎn)品組分】
【儲存條件與保質(zhì)期】
-20℃儲存，有效期為9個月，避免反復(fù)凍融。
【靈敏度】
最低檢驗限：10-100 Copies/Test
【所需其他材料和適用儀器】
熒光定量PCR儀（具有能夠檢測FAM標(biāo)記的熒光通道）、高速離心機、移液器、移液槍頭及離心管等。
【使用指南】
1. 樣品前處理
取適量（如50～100 mg）待檢新鮮樣品組織研磨，并加入1～5倍體積的生理鹽水進行勻漿，取200 μL勻漿液經(jīng)商品化病毒RNA提取試劑盒提取獲得相應(yīng)的RNA待檢樣品，可于-20℃條件下暫存、待用。
2. 加樣、反應(yīng)
從試劑盒中取出預(yù)混液，充分融化，渦旋后短暫離心，分別進行如下操作。
1) 按照需求取n個PCR反應(yīng)管（n=1管陰性對照+待檢樣品數(shù)+1管陽性對照），以上每管中分別加入20 μL預(yù)混液，待用。
2) 向上述n個反應(yīng)管中分別加入陰性對照、DNA待檢樣品、陽性對照各5 μL，蓋緊管蓋，短暫離心，立即進行PCR擴增反應(yīng)。
3) PCR反應(yīng)體系為25 μL，設(shè)置FAM檢測通道讀取，在反應(yīng)階段3中60℃時收集熒光信號，具體程序如下：
反應(yīng) 階段 | 溫度 | 時間 | 信號 收集 | 循環(huán)數(shù) | |
1 | 42℃ | 10 min | 1 | ||
2 | 95℃ | 10 sec | 1 | ||
3 | 95℃ | 5 sec | 40 | ||
60℃ | 30 sec | √ |
注：對于ABI系列熒光定量PCR儀器，其反應(yīng)體系中無需添加ROX，且在軟件設(shè)置時，在“Passive Reference”和“Quencher”處均選擇“None”。
3. 結(jié)果
一般情況下，可通過軟件自動設(shè)定的基線、閾值等直接讀取檢測結(jié)果。如需調(diào)整，可根據(jù)所使用儀器的自身情況（如噪聲等）以及選取的不同熒光通道進行調(diào)整。
1) 質(zhì)量控制：
陰性對照未出現(xiàn)明顯的S型擴增曲線或Ct值＞37，陽性對照出現(xiàn)S型擴增曲線且其Ct值＜30。若陰陽性對照未同時滿足上述條件，則本次檢測結(jié)果無效，應(yīng)重新檢測或與產(chǎn)品技術(shù)支持聯(lián)系。
2) 結(jié)果判讀：
① 無Ct值，且未出現(xiàn)典型的S型擴增曲線，為陰性結(jié)果，判定為TSV未檢出；
② Ct值≤37，且出現(xiàn)典型的S型擴增曲線，為陽性結(jié)果，判定為TSV檢出；
③ Ct值＞37，且出現(xiàn)典型的S型擴增曲線，建議重新檢測，若重檢后Ct值≤37，且出現(xiàn)典型的S型擴增曲線，則判定為陽性結(jié)果，反之則為陰性結(jié)果。
